3. í nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.4. Phương phỏp xỏc định serotype của cỏc chủng vi khuẩn
2.4.4.1. Phương phỏp xỏc định serotype của vi khuẩn P. multocida bằng phản ứng PCR
Thực hiện theo quy trỡnh chuẩn húa của Bộ mụn Vi trựng – Viện Thỳ y quốc gia (Đỗ Ngọc Thỳy và cs, 2007) [21]; cỏc type giỏp mụ A, B, D của vi khuẩn P. multocida được xỏc định dựa trờn phản ứng PCR phức hợp (Multiplex PCR), tức là sử dụng nhiều loại mồi khỏc nhau trong cựng một phản
ứng, gồm cỏc cặp mồi: CAPA-F và CAPA-R để xỏc định serotype A, CAPB-F và CAPB-R để xỏc định serotype B, CAPD-F và CAPD-R để xỏc định serotype D. Trỡnh tự cỏc cặp mồi và kớch cỡ sản phẩm được trỡnh bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trỡnh tự cỏc cặp mồi dựng để xỏc định serotype A, B, D của vi khuẩn P. multocida
Serotype Ký hiệu
mồi Trỡnh tự mồi
Sản phẩm (bp)
A
CAPA-F 5’-TGC CAA AAT CGC AGT GAG-3’
1044 CAPA-R 5’-TTC CCA TCA TTG TCA GTG-3’
B
CAPB-F 5’-CAT TTA TCC AAG CTC CAC C-3’
760 CAPB-R 5’-GCC CGA GAG TTT CAA TCC-3’
D CAPD-F 5’-TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC-3’ 657 CAPD-R 5’-CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG-3’
Quy trỡnh thực hiện phản ứng PCR như sau:
- ADN mẫu của chủng vi khuẩn cần xỏc định được lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của cỏc chủng vi khuẩn đó được nuụi cấy 370C/24h trờn mụi trường thạch mỏu.
- Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tớch là 25 àl, bao gồm cỏc thành phần: 1 àl của mỗi loại mồi (3.2 àM/ àl), 5 àl PCR buffer 5x [(750 mM Tris-HCl (pH 8.8), 200 mM (NH4)2SO4, 0.1% (v/v) Tween 20) (ABgene), 2 mM MgCl2, 200 àM của mỗi loại dNTP], 0.05 àl Taq DNA Polymerase (5 units/ àl) (ABgene), nước cất vừa đủ 25 àl.
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR gồm cỏc giai đoạn: tiền biến tớnh ở 940C/3 phỳt và 30 chu kỳ nhiệt (biến tớnh ở 940C/1 phỳt, ủ bắt cặp mồi ở 550C/1 phỳt, tổng hợp ở 720C/1 phỳt) và kộo dài cuối cựng ở 720
- Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trờn thạch agarose 2% trong dung dịch 1xTAE với hiệu điện thế 100V/30 phỳt, sau đú nhuộm với Ethidium bromide trong 15 - 20 phỳt. Đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc 2000. Cỏc vạch ADN được đỏnh giỏ bằng cỏch so sỏnh với ADN ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương.
2.4.4.2. Phương phỏp xỏc định serotype của vi khuẩn S. suis
Cỏc serotyp 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S. suis thường gặp gõy bệnh nhiều nhất ở lợn được xỏc định bằng phản ứng Multiplex PCR. Cỏc cặp mồi dựng để xỏc định cỏc serotype 1, 2, 7 và 9 của S. suis được lựa chọn dựa vào chuỗi gen mó hoỏ quỏ trỡnh sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giỏp mụ (cps), gồm 4 cặp mồi: cps 1J-F và cps 1J-R để xỏc định serotyp 1, cps 2J-F và cps 2J- R để xỏc định serotyp 2, cps 7H-F và cps 7H-R để xỏc định serotyp 7, cps 9H- F và cps 9H-R để xỏc định serotyp 9. Trỡnh tự cỏc cặp mồi và cỏc sản phẩm tương ứng của chỳng được trỡnh bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trỡnh tự cỏc cặp mồi dựng để xỏc định cỏc serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S. suis
Serotype Ký hiệu mồi Trỡnh tự mồi Sản phẩm (bp) 1 cps1J-F cps1J-R 5'-TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T -3' 5'-TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A-3'
637
2 cps2J-F
cps2J-R
5'-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3' 5'-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC -3'
498
7 cps7H-F
cps7H-R
5'-AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG-3' 5'-TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA-3'
379
9 cps9H-F
cps9H-R
5'-GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT-3' 5'-CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA-3'
Thành phần của phản ứng Multiplex PCR dựng để xỏc định serotype của vi khuẩn S. suis tương tự như trong phản ứng dựng để xỏc định serotype của vi khuẩn P. multocida. Chu kỳ nhiệt của phản ứng gồm: tiền biến tớnh ở 940C/5 phỳt và 35 chu kỳ nhiệt (biến tớnh ở 940C/1 phỳt, ủ bắt cặp mồi ở 530C/1 phỳt, tổng hợp ở 720C/90 giõy), và kộo dài cuối cựng ở 720
C/7 phỳt.