II. PHƯƠNG PHÁP:
2. Đẩy bằng 300 ml đệm ammonium acetae pH 7.2 cĩ nồng độ muối thay đổi từ 0.1 M đến 1M.
GRADIENT %T
%T Dung dịch 25 20 18 16 14 12 10 8 6 4 10(g) 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 3 (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5(µl) 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 1 (ml) 2,5 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 H2O (ml) 0,06 0,16 0,36 0,56 0,76 0,96 1,16 1,36 1,56 1,76
Temed 2 µl/4ml khi cịn mới. Khi lực xúc tác bị yếu đi, tăng thể tích lên cao hơn.
APS/KPS (A/K persulfate): 100mg/ml, pha trước khi dùng. Chỉ dùng dung dịch mới pha 15µl / 4ml khi cịn mới. Khi lực xúc tác bị yếu đi, tăng lên cao hơn.
Để hãm tốc độ polymer hĩa, các dung dịch monomer cần cho xuống 4°C, trước khi thực hiện gradient.
Gel tụ chụm: 2ml dung dịch 2+1ml dung dịch 4+40 µl dung dịch 5+0.96ml H2O+4 µl Temed+30 µl APS.
Bề mặt gel phân giải: Isobutanol hoặc: 0,5 dung dịch 3+20 µl dung dịch 5+1,48 ml H2O
b) Đổ gel và chạy điện di:
- Pha hai dung dịch gel cĩ nồng độ acrylamide 8% và 18% (cĩ SDS) như bảng trên
- Dùng dụng cụ tạo gradient tạo bảng gel phân giải cĩ nồng độ gradient 8 – 18% acrylamide.
Hình 1: Dụng cụ tạo gradient
- Đổ gel tụ chụm cĩ nồng độ acrylamide tổng số 4% - SDS. Đặt lược vào gel để tạo các giếng. Khi gel đơng lấy lược ra và lắp gel vào bình điện di.
- Cho dung dịch đệm vào bình điện di.
- Cho mẫu sau khi xử lý với DTT vào các giếng. - Lắp nguồn điện. Chạy điện di.
- Khi vạch xanh đến đáy thùng. Tắt nguồn. Nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassive trong 15 phút. Tẩy gel với dung dịch tẩy.
PHỤ LỤC 2