II. PHƯƠNG PHÁP:
2. Đẩy bằng 300 ml đệm ammonium acetae pH 7.2 cĩ nồng độ muối thay đổi từ 0.1 M đến 1M.
QUI TRÌNH GÂY MIỄN DỊCH TẠO KHÁNG HUYẾT THANH
I. VẬT LIỆU:
- Súc vật dùng để gây miễn dịch là thỏ.
- Chọn thỏ non khoảng 2 tháng tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng khoảng 1-1,5 kg, nuơi trước theo dõi trong vịng 1 tháng. Sau một tháng chọn những con thỏ khỏe mạnh trọng lượng trên 2kg để gây miễn dịch.
- Độc tố nọc rắn hổ đất và hổ chúa sau tinh chế
- Tá chất Freund tồn phần (complete Freund’s complete adjuvant) (Sigma- Aldrich)
- Tá chất Freund bán phần (incomplete Freund’s incomplete adjuvant) (Sigma- Aldrich)
II. PHƯƠNG PHÁP:
- Trước khi gây miễn dịch, lấy mỗi thỏ 2- 3 ml máu tai. Cho máu đơng ở 4°C trong 12 giờ. Tách huyết thanh và cho chất bảo quản (NaN3 0,05%). Giữ huyết thanh ở 4°C làm mẫu chứng (huyết thanh trước khi gây miễn dịch).
- Thỏ được gây miễn dịch bằng cách tiêm dưới da nhiều mũi kháng nguyên lên lưng thỏ (khoảng 50 µL/mũi). Mỗi lần tiêm cách nhau 1 tháng.
- Lần tiêm thứ 1: tiêm vào mỗi thỏ là 2 ml huyền dịch kháng nguyên trong tá chất Freund hồn tồn.
- Lần tiêm thứ 2 và các lần tiêm sau: tiêm vào mỗi thỏ 2 ml huyền dịch kháng nguyên trong tá chất Freund bán phần.
- Huyết thanh thỏ được lấy khoảng 12 -14 ngày sau mỗi lần gây miễn dịch, bảo quản ở -20°C. Huyết thanh này sẽ được dùng để theo dõi đáp ứng miễn dịch của thỏ
trong suốt quá trình gây miễn dịch bằng phương pháp khuếch tán kép trên thạch và phương pháp ELISA.
- 14 ngày sau lần tiêm thứ 3, 4, lấy máu thỏ (50 ml), tách huyết thanh, tinh chế kháng thể bằng cách tủa với muối ammonium sulfate. Bảo quản tủa sau khi tinh chế ở 40C.
II.1. Tạo huyết thanh kháng độc tố của nọc rắn hổ đất và hổ chúa:
• Lơ I: 3 thỏ (đánh số 17, 18, 19) được gây miễn dịch với độc tố peak 3.1 của nọc rắn hổ đất để tạo huyết thanh kháng độc tố rắn hổ đất. Liều tiêm mũi thứ 1 là 32 µg/thỏ và giảm ½ liều ở những mũi tiêm kế tiếp nhằm chọn lọc các dịng tế bào B sản xuất kháng thể cĩ ái lực cao.
• Lơ II: 4 thỏ (đánh số 13, 14, 15, 16) được gây miễn dịch với độc tố peak 3 của nọc rắn hổ chúa để tạo huyết thanh kháng độc tố rắn hổ chúa. Liều tiêm mũi thứ 1 là 50 µg/thỏ và giảm ½ liều ở những mũi tiêm kế tiếp.
II.2. Tạo huyết thanh kháng đa độc tố hai lồi rắn hổ đất và hổ chúa:
• Lơ III: 4 thỏ (đánh số 7, 8, 11, 12) được gây miễn dịch với cả hai loại độc tố trên để tạo huyết thanh kháng đa độc tố. Liều tiêm mũi thứ 1 là 32 µg độc tố peak 3.1 của nọc rắn hổ đất/thỏ và 50 µg độc tố peak 3 của nọc rắn hổ chúa/thỏ và giảm ½ liều ở những mũi tiêm kế tiếp.
II.3. Phương pháp kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ bằng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch:
Đây là một kỹ thuật cổ điển, dùng để phân tách các kháng thể trong mẫu thử nghiệm về tính đặc hiệu với kháng nguyên.
II.3.1. Nguyên tắc:
Làm một thạch agar 1% trên phiến kính. Đục các giếng ở các vị trí đã định. Cho các dung dịch kháng nguyên, kháng thể vào đúng giếng đã định. Kháng nguyên và kháng thể sẽ khuếch tán trong gel. Khi gặp nhau chúng sẽ hình thành phức hợp và sẽ
tủa nếu nồng độ kháng nguyên và kháng thể tương ứng. Hình của vết tủa cho phép phân tách về phản ứng giữa các thành phần trong các giếng.
II.3.2. Vật liệu:
- Agarose
- Dung dịch huyết thanh thỏ trước khi gây miễn dịch - Dung dịch huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch lần 3 - Hĩa chất khác đều đạt mức độ phân tích
II.3.3. Tiến hành:
- Làm thạch agar 1% (6 x 6 x 0,2cm) trong đệm Veronal 20 mM pH 8.6
- Đục các giếng (thể tích của một giếng khoảng 20 µl) trên thạch và cho mẫu vào các giếng
- Để thạch vào hộp đĩng kín: 100% độ ẩm ở 40C. Quan sát kết quả sớm nhất là sau 24 giờ.
PHỤ LỤC 3
Đề tài nghiên cứu này sẽ được đăng trong số 6 (105) của tạp chí Y Học Dự Phịng xuất bản vào tháng 10/2009.