cho sản phẩm khuếch đại rõ nét. Tuy nhiên chúng tơi chọn thời gian kéo dài là 30 giây để sử dụng trong quy trình nhằm rút ngắn quy trình kiểm mẫu.
4.4. KIỂM CHỨNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CSFV BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR RT-PCR
4.4.1. Kiểm chứng quy trình
Chúng tơi tiến hành kiểm chứng quy trình RT-PCR đã thiết lập với các mẫu bệnh phẩm được Trung Tâm Thú Y Vùng cung cấp. Các mẫu này đã được kiểm tra sự hiện diện của virus CSFV bằng phương pháp ELISA. Thí nghiệm được tiến hành song song
Hình 24:Khảo sát thời gian bắt cặp
1: Thang DNA 50bp; 2: 1 phút; 3: 45 giây; 4: 30 giây
Hình 25:Khảo sát thời gian kéo dài
1: Thang DNA 50bp; 2:1 phút; 3: 45 giây; 4:30 giây
với một mẫu đối chứng âm trong đĩ RNA bản mẫu được thay thế bằng nước cất vơ trùng. Kết quả kiểm chứng được trình bày trong (hình 26).
Trong các mẫu bệnh phẩm chỉ cĩ mẫu 3 (giếng 5) và mẫu 7 (giếng 9) cho kết quả âm tính, các mẫu cịn lại đều dương tính. Kết quả này được đối chứng so sánh với kết quả ELISA của Trung Tâm Thú Y vùng như trình bày ở bảng 5.
Bảng 5: Kiểm chứng quy trình phát hiện CSFV bằng phản ứng RT-PCR
Ký hiệu mẫu Địa phương Kết quả RT-PCR Kết quả ELISA
1 Đồng Nai + + 2 + + 3 - - 4 + + 5 Biên Hịa + + 6 + + 7 Vũng Tàu - - 8 + + 9 Củ Chi + + 10 + +
Như vậy kết quả trên đúng với kết quả đối chứng nhận được từ Trung Tâm Thú Y Vùng. Cĩ thể kết luận rằng cĩ sự đồng nhất về kết quả của phương pháp ELISA và RT- PCR. Tỉ lệ tin cậy là 100% trên 10 mẫu kiểm chứng.
4.4.2. Khảo sát độ chuyên biệt của quy trình RT-PCR
Tính chuyên biệt của quy trình được khảo sát dựa trên khả năng khuếch đại chuyên biệt đối với CSFV của phản ứng RT-PCR trong sự hiện diện của các đối tượng vi sinh khác cĩ thể cĩ trong mẫu bệnh phẩm. Salmonella Typhimurium là tác nhân gây bệnh phĩ thương hàn ở heo. Bệnh này cĩ các biểu hiện gần giống như bệnh dịch tả heo, do đĩ, rất cĩ thể cĩ sự nhầm lẫn trong chẩn đốn lâm sàng. Chúng tơi tiến hành bổ sung Salmonella Typhimurium vào các mẫu bệnh phẩm đã được kiểm chứng bằng phương
Hình 26: Kiểm chứng quy trình phát hiện CSFV Giếng 1: Thang DNA
50bp; 2: Đối chứng âm; 3: Mẫu 1; 4: Mẫu 2; 5: Mẫu 3; 6: Mẫu 4; 7: Mẫu 5; 8: Mẫu 6; 9: Mẫu 7;10: Mẫu 8; 11: Mẫu 9; 12: Mẫu 10
pháp ELISA của Trung Tâm Thú Y vùng, thu nhận RNA và thực hiện phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu cho CSFV. Kết quả thí nghiệm được trình bày trên bảng 6 và hình 27.
Bảng 6: Kết quả phản ứng RT-PCR với cặp mồi chuyên biệt đối với CSFV thực hiện trên
21 mẫu bệnh phẩm nhiễm Salmonella.
STT Ký hiệu mẫu Tình trạng mẫu Kết quả phản ứng RT-PCR thực hiện cho mẫu nhiễm Salmonella 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 D9M D7M T36M T37M D8M T38M LD1 T35L D9BH LDL1 LD2 D9T D6M T39M D6BH T39 T35BH T35L LD3 T35M LDL2 + - + + - - + + + + + + - - - - - - + + + + - + + - - + + + + + + - - - - - - + + +
Chú thích: (+) Mẫu nhiễm CSFV; (-) Mẫu khơng nhiễm CSFV
Số liệu trình bày trên bảng 6 cho thấy cặp mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR là chuyên biệt cho CSFV và kết quả của phản ứng RT-PCR phản ánh đúng tình trạng mẫu. Trong hình 27, các mẫu âm tính CSFV nhiễm Salmonella (giếng 2, 3, 4, 5, 10) khơng cho thấy vạch khuếch đại, các mẫu dương tính CSFV nhiễm Salmonella (giếng 6, 7, 8, 9) cho vạch sản phẩm đúng với đoạn gen 287 bp của CSFV và khơng cĩ vạch ký sinh. Từ các số liệu trên, cĩ thể kết luận là phản ứng RT-PCR thực hiện là chuyên biệt với CSFV và kết quả của phản ứng khơng bị ảnh hưởng khi mẫu cĩ sự hiện diện của Salmonella.
Sự chuyên biệt của qui trình đối với CSFV khi so với các virus khác thuộc chi Pestitivirus cịn được khảo sát thơng qua độ chuyên biệt của cặp mồi phát hiện CSFV và trình tự của sản phẩm khuếch đại (287 bp).
Khảo sát độ chuyên biệt của cặp mồi
Khi khảo sát khả năng bắt cặp của mồi CSF – CSR đã sử dụng trong qui trình với bộ gen của BVDV và BDV, kết quả cho thấy cặp mồi này khơng bắt cặp tại vị trí nào trong vùng 5’UTR của BVDV và BDV. Nĩi cách khác, cặp mồi này hồn tồn chuyên biệt cho CSFV và sẽ khơng cho sản phẩm khuếch đại đối với bộ gen của BVDV và BDV.
Khảo sát trình tự của sản phẩm khuếch đại
Chúng tơi sử dụng kết quả giải trình tự sản phẩm khuếch đại thu nhận được từ qui trình RT-PCR (được lưu trữ trong ngân hàng gen với mã số là AY306121) và so sánh với trình tự đoạn 5’UTR của các virus thuộc chi Pestivirus (CSFV, BVDV, BDV). Kết quả cho thấy trình tự vùng 5’UTR của CSFV sai khác lớn so với trình tự 5’UTR của BVDV (mức độ tương đồng là 55,1%) và tương đối khác biệt với trình tự 5’UTR của BDV (tương đồng 79,8%). Trong khi đĩ, trình tự này cĩ sự tương đồng đối với vùng 5’UTR của các chủng CSFV ở các nước trên thế giới như: Chủng C (93%), chủng Afort/187 (93%), chủng Eystrup (94%).
4.4.3. Ứng dụng quy trình RT-PCR trong kiểm mẫu bệnh phẩm
Mẫu lấy lần thứ nhất: Lâm trường Mã Đà-Đồng Nai gồm heo số 1 và số 2. Mẫu lấy lần thứ hai: Bà Rịa-Vũng Tàu gồm heo số 3 và số 4.
Hình 28: Kết quả sản phẩm PCR
trên các mẫu lấy từ thực địa 1: Thang DNA 50bp
2: heo số 1 3: heo số 2 4: heo số 3 4: heo số 4
Hình 27: Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR thực hiện trên các
mẫu bệnh phẩm nhiễm Salmonella.
1. Thang DNA 100 bp; 2. Mẫu D6M; 3. Mẫu D7M; 4. Mẫu D8M; 5. Mẫu T39M; 6. Mẫu T35M; 7. Mẫu T36M; 8. Mẫu T37M ; 9. Mẫu D9M;10. Mẫu T38M
Kết quả RT-PCR cho thấy 4 mẫu đều cho kết quả dương tính. Như vậy cĩ sự hiện diện virus dịch tả heo ở cả 4 heo. Kết quả này phù hợp với những triệu chứng lâm sàng của heo bệnh được ghi nhận khi lấy mẫu.
Từ các kết quả khảo sát chúng tơi xây dựng được quy trình phát hiện CSFV bằng phản ứng RT-PCR như sau:
QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CSFV BẰNG RT - PCR
Thu nhận RNA tổng số
1. Đồng nhất mẫu trong dung dịch Trizol
2. Pha tách biệt (Thêm Chloroform) 3. Tủa RNA
4. Rửa và hồ tan tủa Mẫu bệnh phẩm (100mg hoặc 200 l máu)
RT PCR 1 g RNA tổng số + 3 l BSA 0,1% Chương trình nhiệt 85oC - 10 phút Giữ 4oC
Điện di phân tích kết quả
Xử lý mẫu Chương trình RT 37oC - 60 phút 94oC - 10 phút 1. dNTP 0,1mM 2 l 2. RT buffer 5X 4 l 3. DTT 0,1M 0,5 l 4. Mồi 1pmol 1 l 5. RNASin 30U 1 l 6. MMLV 10 U 0,5 l 7. RNA xử lý + H2O Bổ sung đủ 20 l Chương trình RT 37oC - 60 phút 94oC - 10 phút 1. MgCl2 25mM 0,5 l 2. dNTP 0,1 mM 2,5 l 3. PCR buffer 10X 2,5 l 4. Mồi CSR, CSF 5pmol 1 l 5. Taq polymerase 0,5 l 6. Sản phẩm RT 4 l 7. H2O 14 l Chương trình PCR 94oC - 4 phút 94oC - 1 phút 57oC - 45 giây 72oC - 30 giây 72oC - 5 phút 30chu kỳ
PHẦN V: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
Với mong muốn giải trình tự đoạn 5’UTR của CSFV phân lập tại Việt Nam nhằm mục đích nghiên cứu phân loại và hỗ trợ cho phương pháp RT-PCR phát hiện trong quá trình thí nghiệm, đồng thời xây dựng một quy trình phát hiện nhanh virus dịch tả heo, trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tơi đã thu được các kết quả sau:
1. Thu nhận đoạn gen 5’UTR từ CSFV phân lập tại Việt Nam. 2. Tạo dịng tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp pBlue-5’UTR.
3. Giải trình tự đoạn gen 5’UTR của virus dịch tả heo ở Việt Nam và so sánh với trình tự 5’UTR ở các chủng khác.
4. Thiết kế cặp mồi chuyên biệt cho CSFV để phát hiện CSFV bằng RT-PCR. 5. Xây dựng được quy trình phát hiện virus dịch tả heo (CSFV) bằng phương pháp
RT-PCR với các thơng số đã được khảo sát, tối ưu sau:
- Quy trình tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm
- Nồng độ MMLV ( 5 U/20 l thể tích phản ứng RT) - Nồng độ mồi CRS (0,05 pmol/20 l thể tích phản ứng RT) - Nồng độ dNTP (0,01 mM/20 l thể tích phản ứng RT) - Nồng độ dNTP (0,01 mM/25 l thể tích phản ứng PCR) - Nồng độ mồi CRS-CRF (0,2 pmol/25 l thể tích phản ứng PCR) - Mg2+ với nồng độ 0,5 mM/25 l thể tích phản ứng PCR
- Nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 570C
- Thời gian bắt cặp 45 giây
- Thời gian kéo dài 30 giây
5.2. ĐỀ NGHỊ
Các kết quả thu được của đề tài là bước mở đầu cho các nghiên cứu phân loại CSFV sau này. Đồng thời, việc nghiên cứu và đưa vào ứng dụng quy trình phát hiện virus dịch tả heo cĩ ý nghĩa trong thực tiễn phát triển ngành chăn nuơi ở nước ta. Để đề tài được hồn thiện hơn chúng tơi đề nghị :
- Tiếp tục đi sâu nghiên cứu, so sánh vùng gen 5’UTR của CSFV.
- Phân lập thêm, dịng hĩa và giải trình tự vùng gen 5’UTR của một số chủng CSFV phân lập tại Việt Nam nhằm mục đích so sánh và nghiên cứu sự biến chủng.
- Tiếp tục mở rộng việc thu nhận, lấy mẫu từ thực địa và ứng dụng quy trình để kiểm tra phát hiện virus CSFV.
- Tiến hành các khảo sát đánh giá hiệu lực để quy trình phát hiện CSFV bằng RT-PCR đã xây dựng cĩ thể được dùng như một phương pháp thường quy.
PHẦN VI: SO SÁNH CÁC NỘI DUNG ĐĂNG KÝ VAØ KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
Nội dung đăng ký Kết quả thực hiện
Dịng E. coli tái tổ hợp mang gen
5’UTR của CSFV Tạo được tái tổ hợp pBlue-5’UTR/DH5 dịng tế bào E. coli mang plasmid Trình tự gen 5’UTR của CSFV tại
miền Nam Việt Nam
Trình tự gen 5’UTR được đăng ký trong ngân hàng gen với mã số AY306121 Quy trình chẩn đốn sớm bệnh dịch
tả heo bằng RT-PCR
Đã tối ưu hĩa quy trình cho phép chẩn đốn sớm bệnh dịch tả heo, cho kết quả trong vịng 6-8 giờ, cho phép phát hiện sự hiện của RNA CSFV ở nồng độ 10pg
Bộ KIT chẩn đốn sớm bệnh dịch tả
heo Để trở thành một phương pháp chẩn đốn thường quy cần tiến hành đánh giá hiệu lực thứ cấp
PHẦN VII: CÁC THAØNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TAØI 1. PGS. TS. Trần Linh Thước 2. CN. Huỳnh Ngọc Vi Ca 3. CN. Phạm Hồng Ánh 4. CN. Trần Văn Hiếu 5. CN. Nguyễn Trí Nhân 6. CN. Cao Thị Ngọc Phượng 7. CN. Nguyễn Thị Thanh Điều
PHẦN VIII: CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TAØI
N. T. Nhân, Đ.T.P. Thảo, T.L.Thước (2004). Thiết lập và đánh giá hiệu lực sơ bộ quy trình phát hiện nhanh virus dịch tả heo bằng kỹ thuật RT-PCR. Báo cáo khoa học “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống” – Định hướng Nơng Lâm nghiệp Miền núi Thái Nguyên, trang 547 – 551.
TAØI LIỆU THAM KHẢO
TAØI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang. Di truyền phân tử – Những nguyên tắc trong chọn giống cây trồng. NXB. Nơng nghiệp.
2. Đào Trọng Đạt. Bệnh Dịch tả lợn cổ điển, Dịch tễ – Chẩn đốn – Chương trình kiểm sốt.
3. Henry Too, Sacha Seneque. Bệnh dịch tả heo – Cẩm nang cho nhà chăn nuơi chuyên nghiệp. Merial Asia Private Limited.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997). Sinh học phân tử. Chương X, XIII, trang 135- 140; 173-189, NXB Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Tiến Dũng (1996). Tình hình bệnh dịch tả heo trên thế giới và hướng phịng trị.
6. Nguyễn Tiến Hà (2001). So sánh độ nhạy và ứng dụng hai phương pháp ELISA và phân lập virus trên tế bào PK-15 trong chẩn đốn virus dịch tả heo. Luận văn tốt nghiệp, Tủ sách Đại học Nơng Lâm, Tp HCM.
7. Nguyễn Vĩnh Phước. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc. NXB Nơng nghiệp, trang 150-195.
8. Phạm Sỹ Lăng, Phan Địch Lân, Trương Văn Dung. Bệnh phổ biến ở lợn và phương pháp phịng trị.
9. Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học phân tử (2001). Tài liệu tập huấn các kỹ thuật giải trình tự nucleotide. Đại học Khoa học tự nhiên Tp. HCM.
10. Trần Linh Thước (2002). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Trang 169-170, NXB Giáo dục.
11. Trần Linh Thước (2002). Thực tập di truyền tái tạo dịng (Cơng nghệ sinh học). Khoa sinh, Đại học Khoa học tự nhiên Tp. HCM.
12. Trương Thị Nga (2002). Thăm dị hàm lượng kháng thể thụ động dịch tả heo trên heo con để xác định thời gian tiêm chủng vaccine lần đầu. Khĩa luận tốt nghiệp. Khoa chăn nuơi thú y. Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh.
13. Vũ Triệu An (2001). Miễn dịch học. Trang 121-122, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
TAØI LIỆU TIẾNG ANH
14. Alan J, Cann (1998). Principles of Molercular Virology. University of Leicester. UK: Academic Press. p.66 – 104.
15. Claudio WC, Isido H, Laura, Paulo M & AviMasuda (1996). Differentiation of Classiacal swine fever virus from ruminant pestivirus by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR). Veterinary Microbiology 48, pp.373-379.
16. Edwar Alacmo (1996). DNA technology The awesome skill. Chapter 5, 97-113, Wm. C. Brown Publishers.
17. Harding, Lutze-Wallace C, Zhong X, Rola J (1994). Reverse transcriptase- PCR assay for detection of hog cholera virus. J Clin Microbiol. 32(10): 2600-2. 18. Hulst, M. M., F. E. Panoto , A. hoekman, H. G. P. van Gennin, R. J. M.
Moormann (1988). Inactivation of the RNase activity of glycoprotein Erns of classiacal swine fever virus result in a cytopathogenic virus. J. Virol, pp. 151-157. 19. J. T. Van Oischot (1992). Hog cholera. Diseases of swine. 7th ed. Iowa USA:
Iowa State University Press, Ames.
20. Li Hong Wei, Tu Chang Chun., Jin Kuo Shi & Zhang JinGang (1995).
Amplication and cloning the 5’ regulator sequence and P23 gene of Hog cholera virus strain C. Annual anthology of university of Agriculture and Animal Science, PLA, pp. 7-10.
21. Liu ST, Wang DC, Chang SF, Chiang SC, Ho WC (1991). Rapid detection of hog cholera virus in tissues by the polymerase chain reaction. J Virol Methods.35 (2) : 227-36.
22. Michael T.M., John M.M. & Jack P (2000). Brock Biology of Microorganism. Ninth edition, Prentice Hall International, Inc, chapter 9, 306-307; chapter 10, 345-353.
23. M. M. Hulst, F. E. Panoto, A. Hoekman, H. G. P. van Gennip, R. J. M. Moormann. Inactivation of the RNase Activity of Glycoprotein Erns of Classical Swine Fever Virus Results in a Cytopathogenic Virus. 1997.
24. Sakoda. Y, Ozawa.S, Damrongwatanapokin. S, Sato. M, Ishikawa. K & Fukusho. A (1998). Genetic heterogeneity of porcine and ruminant pestiviruses mainly isolated in Japan. Veterinary Microbiology 65, pp. 75-86.
25. Zhang F, Syseng K, Zhang N & Blacksell (1999). Consideration regarding the transport of sample and development of diagnostic protocols for the detection of Classiacal swine fever virus under endemic conditions. Classiacal swine fever and Emerging Disease in Southeast Asia, pp. 31-37.
TAØI LIỆU TỪ CÁC TRANG WEB
26. http://www.ars.usda.gov/cholera.html 27. http://www.cidrap.umn.edu/cidrap/content/biosecurity/ag-biosec/anim- isease/csf.html 28. http://www.cvm.tamv.edu/description-viruses/flavi.html 29. http://www.niah.affrc.go.jp/niah99007-e.html 30. http://www.triroc.com/sunnen/topics/virology.htm 31. http://rover.vetmed.lsu.edu/student/y4/boardstuff/swinerev.doc 32. http://wc.pima.edu/~lwerner/Biotech/298/Handouts/Optimizing Amplification.htlm 2