2.8.1. KHÁI NIỆM VỀ TẠO DỊNG
Tạo dịng là một trong những bước cơ bản của cơng nghệ gen. Mục đích của việc tạo dịng là nhằm thu nhận một lượng lớn và tinh khiết các trình tự DNA xác định một cách dễ dàng hay nhằm thu nhận một dịng tế bào cĩ khả năng biểu hiện gen mục tiêu.
2.8.2. CÁC PHƯƠNG TIỆN DÙNG TRONG TẠO DỊNG
DNA nguyên liệu cho tạo dịng Các vector
Enzyme: gồm enzyme giới hạn và các enzyme thơng dụng khác
2.8.2.1. DNA nguyên liệu cho tạo dịng [4]
Nguồn DNA nguyên liệu dùng trong tạo dịng rất đa dạng. Chúng cĩ thể là DNA bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu, đoạn DNA tổng hợp từ khuơn RNA dưới tác động của enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase), DNA sản phẩm của phản ứng PCR dưới sự tổng hợp của DNA polymerase hay các DNA tổng hợp in vitro.
2.8.2.2. Các vector dùng trong tạo dịng
a) Khái niệm vector [4]
Vector là một DNA, thường cĩ dạng vịng, mang nhiều đặc tính trong đĩ cĩ khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mượn bộ máy di truyền tế bào vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu.
Các ứng dụng chủ yếu của vector là:
Tạo dịng để khuếch đại số lượng bản sao một trình tự DNA xác định.
Chuyển các gen vào trong tế bào hay vào cơ thể (tạo các sinh vật chuyển gen - GMO, gene transformatic organism).
Sản xuất RNA với số lượng lớn từ DNA được tạo dịng. Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA được tạo dịng.
b) Những đặc tính chung của vector [4, 16]
Vector phải cĩ các trình tự khởi sự sao chép (ori) để cĩ thể tự sao chép và tồn tại độc lập với sự sao chép bộ gen của tế bào chủ.
Vector phải cĩ kích thước càng nhỏ càng tốt để cĩ thể thu nhận một lượng DNA tối đa. Hơn nữa, kích thước vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh và cĩ hiệu quả.
Vector phải cĩ các gen chọn lọc để dễ dàng phát hiện ra chúng hoặc các gen lạ gắn vào. Thơng thường đĩ là đặc tính kháng với kháng sinh giúp vi khuẩn cĩ mang vector sống được trên mơi trường cĩ kháng sinh, hoặc khả năng sản sinh một enzyme ( - galactosidase của operon lactose) chuyển hố một cơ chất tạo màu phát hiện được trên mơi trường thạch.
Vector phải cĩ trình tự nhận biết (palindromic), nơi mà các restriction endonuclease nhận biết để cắt hở làm chỗ ráp đoạn gen lạ vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm xuất phát sao chép để tránh bị cắt nhầm.
Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và phải gây ít xáo trộn nhất cho tế bào chủ.
Ngồi ra chúng cịn phải cĩ những đặc tính bổ sung khác để cho việc tạo dịng dễ thực hiện:
Chứa các gen làm vơ hiệu hĩa đoạn DNA khơng mong muốn bị gắn vào.
Cĩ các trình tự nucleotide cần thiết cho sự biểu hiện của gen như promoter, trình tự gắn với ribosome để dịch mã (ribosome binding site).
Giá trị của các vector ở chỗ nĩ được cấu tạo như thế nào để thuận tiện cho mục đích sử dụng. Một vector được xem là càng mạnh khi càng cĩ nhiều các đặc tính trên.
Một vector được coi là mạnh khi càng mang nhiều những đặc tính kể trên. Cĩ nhiều loại vector: plasmid, cosmid, phage, YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men), MAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật cĩ vú).…
c) Các vector plasmid [4]
Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5kb), dạng vịng, nằm ngồi nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn. Mỗi vi khuẩn cĩ thể chứa hàng trăm plasmid. Vector này cĩ thể nhận 8-9kb DNA cần dịng hĩa.
Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid đã khơng ngừng được cải tiến để ngày càng thuận tiện hơn cho kỹ thuật tái tổ hợp DNA.
2.8.2.3. Chọn tế bào chủ [16]
Một số tế bào chủ lý tưởng cho tạo dịng cần cĩ những đặc tính sau : - Tăng trưởng nhanh chĩng.
- Phát triển mạnh trên mơi trường nuơi cấy khơng mắc tiền. - Khơng gây hại hoặc lây bệnh.
- Cĩ khả năng thu nhận DNA.
- Ổn định trong mơi trường nuơi cấy.
Tế bào chủ phải mang những enzyme thích hợp cho sự sao chép của vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào chủ thích hợp sẽ cho phép vector cĩ khả năng tồn tại ổn định và tự sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào chủ phải mang những enzyme thích hợp cho sự sao chép của vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào chủ thích hợp sẽ cho phép vector cĩ khả năng tồn tại ổn định và tự sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Những tế bào chủ hữu dụng nhất cho tạo dịng là những vi sinh vật tăng trưởng nhanh, thơng tin di truyền đầy đủ và thao tác gen dễ dàng, bao gồm tế bào prokaryote như vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis và tế bào eucaryote như nấm men Saccharomyces cerevisiae, tế bào động vật.
2.8.2.4. Các enzyme dùng trong tạo dịng [4, 16]
Enzyme dùng trong tạo dịng gồm hai nhĩm lớn là enzyme giới hạn và các enzyme thơng dụng khác.
a) Các enzyme giới hạn (Restriction enzyme, RE)
Enzyme giới hạn là các endonuclease cĩ khả năng thủy giải DNA mạch đơi một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định.
Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trưng. Các trình tự này thường bao gồm 4-8 nucleotide. Các RE khác nhau cĩ thể cĩ cùng trình tự nhận biết và đối với một số RE, trình tự nhận biết khơng cĩ tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự cĩ thể được thay thế bởi nucleotide khác.
Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng cĩ cấu trúc palindrom, nghĩa là những đoạn DNA mạch đơi cĩ trình tự nucleotide của hai mạch đơn giống nhau theo chiều 5’ 3’. Như vậy, vị trí cắt là giống nhau trên cả hai mạch.
Cắt tạo đầu bằng (blunt ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ khơng cĩ khả năng tự kết hợp trở lại. Để nối chúng lại phải dùng enzyme nối T4 ligase.
Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung cĩ thể bắt cặp trở lại. Đặc tính này được sử dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro, hai phân tử DNA cĩ nguồn gốc khác nhau nhưng cùng được cắt bởi một RE sẽ cĩ khả năng kết hợp thành một thơng qua các đầu dính.
b) Các enzyme thơng dụng khác
Các polymerase: gồm các DNA polymerase và RNA polymerase. DNA polymerase được quan tâm nhiều trong tạo dịng. Các DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’ 3’. Phần lớn các DNA polymerase dùng mạch DNA làm khuơn cho sự tổng hợp. Một số DNA polymerase thường dùng trong tạo dịng là DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase, Pfu DNA polymerase.
Các ligase
Đây là các enzyme xúc tác sự hình thành liên kết phosphodiester nối hai đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase). Trong kĩ thuật tạo dịng (lĩnh vực sử dụng quan trọng nhất của các ligase), chúng thường được sử dụng kết hợp với hai enzyme khác là T4 polynucleotide kinase và Alkaline phosphatase. Ngồi ra cịn cĩ các loại như E. coli
DNA ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase. Các nuclease
Đây là nhĩm các enzyme phân cắt DNA (DNase) và RNA (RNase). Các enzyme giới hạn đề cập ở trên cũng là những nuclease nhưng mang tính chuyên biệt trình tự cao hơn. Các nuclease chính bao gồm các enzyme sau: DNase I, nuclease S1, exonucleaseIII, Rnase A, RNase H,…
2.8.3. CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG TẠO DỊNG [4, 16]
Tùy thuộc vào loại thư viện gen cần thiết lập, các nhân tố tham gia vào quá trình tạo dịng cĩ thể thay đổi, nhưng tiến trình thực hiện đều bao gồm các bước sau:
Chọn và xử lý vector. Xử lý DNA cần tạo dịng. Tạo vector tái tổ hợp.
Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Phát hiện dịng cần tìm trong thư viện gen.
2.8.3.1. Chọn và xử lý vector
Việc chọn lọc vector phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước các đoạn DNA muốn tạo dịng, mục đích tạo dịng…
Việc xử lý vector sẽ tùy thuộc vào chiến lược tạo dịng. Thơng thường, vector sẽ được cắt mở vịng bằng RE ở một hoặc hai vị trí xác định. Sau đĩ, hai đầu chỗ mối cắt được xử lí để chúng khơng thể nối trở lại; vector chỉ cĩ thể trở lại dạng vịng ban đầu khi
hai đầu chỗ mối cắt được nối với một trình tự DNA lạ. Điều này nhằm tránh sự hình thành các dịng vi khuẩn mang vector khơng tái tổ hợp.
2.8.3.2. Xử lý DNA cần tạo dịng
DNA mục tiêu cĩ thể được khuếch đại trực tiếp từ DNA bộ gen thơng qua phương pháp PCR hay cắt trực tiếp từ một lượng lớn DNA bộ gen ban đầu.
DNA mục tiêu được dùng để tạo dịng phải cĩ kích thước tương ứng với loại vector đã chọn. Hai đầu của DNA này cần phải xử lý cho phù hợp với hai chỗ mối cắt của vector. Nếu ở giữa các đoạn DNA mục tiêu hay cDNA cĩ các điểm nhận biết của RE, cĩ thể dùng enzyme methylase hĩa đoạn đĩ. DNA sẽ tránh được sự cắt của các RE này.
2.8.3.3. Tạo vector tái tổ hợp
Vector và DNA cần tạo dịng đã được xử lý sẽ được nối theo một tỷ lệ nhất định với sự hiện diện của ligase. Ligase xúc tác phản ứng nối vector với DNA mục tiêu tạo thành vector tái tổ hợp (recombinant).
2.8.3.4. Chuyển gen tái tổ hợp vào tế bào chủ
Cơng đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Kĩ thuật chuyển được sử dụng sẽ tùy thuộc vào loại tế bào chủ.
2.8.3.5. Phát hiện và chọn lọc dịng cần tìm trong thư viện gen [14, 18]
Kết quả phản ứng nối một trình tự DNA và một vector đã được mở vịng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối như vector-vector, vector-DNA mục tiêu… Do đĩ, các thể biến nạp sau khi được nuơi trên mơi trường dinh dưỡng cĩ thể phát triển thành các dịng vi khuẩn sau:
- Tế bào khơng nhận được plasmid.
- Tế bào nhận được plasmid khơng cĩ gen lạ vào. - Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tổ hợp.
Để cĩ thể phân lập dịng tế bào chủ tái tổ hợp chứa gen mục tiêu trong thư viện DNA hay thư viện cDNA, người ta sử dụng các phương pháp sàng lọc. Phổ biến là các phương pháp sau:
- Phát hiện kiểu hình nhờ bổ sung ( -complementation).
- Xác định thể biến nạp cĩ mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp lai (lai khuẩn lạc).
- Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc, PCR với khuơn mẫu là plasmid tách chết từ thể biến nạp).
- Phương pháp miễn nhiễm.
- Dựa vào các gen phát sáng như GFP…
a) Phát hiện kiểu hình nhờ bổ trợ
Nhiều vector được sử dụng (như họ pUC, pBluescript, pGem…) mang một đoạn ngắn của trình tự điều hồ mã hố (lacZ) cho 146 amino acid đầu tiên của enzyme - galactosidase xúc tác phản ứng dị hố đường lactose, -protein đầu N. Việc chèn vào vùng mã hố của gen này một đoạn MCS (multicloning site) chứa các vị trí cắt hạn chế
duy nhất (vẫn duy trì khuơn đọc) sẽ tạo thêm vài amino acid trong -protein mà khơng ảnh hưởng đến chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ được sử dụng với chủng chủ biểu hiện phần đầu C của -galactosidase, -protêin đầu N. Hai prorein bất hoạt của - galactosidase E. coli ( và -protein ) kết hợp với nhau hình thành một enzyme cĩ chức năng gọi là hiện tượng -complementation. Điều này cũng cĩ nghĩa là, nếu một hệ thống, cĩ đột biến mất đoạn đầu của đoạn vận hành (operator segment) của lacZ trên plasmid, được bù đắp nhờ các thể đột biến âm của -galactosidase cĩ operator nguyên vẹn ở tế bào chủ, sẽ cĩ kiểu hình Lac+. Các vi khuẩn cĩ kiểu hình Lac+ - khuẩn lạc cĩ - complementation được phát hiện nhờ sự đổi màu của X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-
-D-galactoside) làm khuẩn lạc cĩ màu xanh.
Khi chèn đoạn DNA vào MCS của các vector (ví dụ, pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành -protêin đầu N. Do đĩ, hiện tượng -complementation khơng xảy ra, phản ứng phân cắt X-gal khơng thực hiện đuợc. Vì vậy, các tế bào vi khuẩn mang các plasmid tái tổ hợp này sẽ cho khuẩn lạc màu trắng.
b) Mất hoạt tính do xen đoạn [16]
Phương pháp này được sử dụng với các vector cĩ mang hai hay nhiều hơn các gen kháng thuốc và trên các gen này cĩ những điểm nhận biết của các enzyme restriction endonuclease. Các đoạn DNA cần gắn vào plasmid được phân cắt với restriction enzyme mà điểm nhận biết của chúng nằm chỉ trên một gen kháng kháng sinh (ví dụ, gen kháng ampicillin Ampr, gen kháng tetracycline TerR). Nếu đoạn DNA lạ xen vào giữa gen TetR sẽ làm mất hoạt tính kháng tetracycline do đĩ phương pháp này đươc gọi là mất hoạt tính do xen đoạn (insertional inactivation).
Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ cĩ khả năng sinh trưởng trên mơi trường cĩ kháng sinh. Do đĩ, khi trải E. coli biến nạp lên mơi trường chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới cĩ thể sinh trưởng. Các tế bào khơng tiếp nhận plasmid sẽ khơng sinh trưởng được.
c) Phương pháp PCR khuẩn lạc
Phương pháp PCR khuẩn lạc cũng dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp PCR. Tuy nhiên, DNA bản mẫu khơng được đưa trực tiếp trong thành phần của phản ứng mà được đưa vào dưới dạng nằm trong tế bào. Khi phản ứng PCR xảy ra, nhiệt độ cao sẽ phá vỡ màng tế bào và DNA thốt ra ngồi trở thành DNA bản mẫu.
PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 3.1. HĨA CHẤT VAØ MƠI TRƯỜNG
3.1.1. Hĩa chất
Hố chất dùng để tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
- Dung dịch I: Glucose 50 mM Tris-HCl pH8 25 mM EDTA pH8 10 mM
- Dung dịch II (pha trước khi dùng)
SDS10% 100 l
NaOH 5N 40 l
Nước cất 860 l
Tổng thể tích 1000 l
- Dung dịch III (KOAC) pH4,8
Glacial acetic 0,2 M Potassium acetate 0,2 M
- RNAse 1mg/ml
- Phenol pH 8 bão hịa trong TE
- Chloroform - Isopropanol lạnh (giữ ở –20oC) - Ethanol 70% lạnh (giữ ở –20oC) - Dung dịch TE (vơ trùng): Tris-HCl pH8 10mM EDTA 1mM
Hĩa chất dùng để biến nạp plasmid vào vi khuẩn
- Dung dịch CM: CaCl2 5% MgCl2 15%
- CaCl2 100mM lạnh (giữ ở 4oC)
- Ampicillin 50 g/ml (pha trong nước cất vơ trùng)
Hĩa chất dùng cho bảo quản giống
Glycerol 80% vơ trùng
Hĩa chất tách chiết RNA tổng số
Dung dịch ly giải I: 4M Guanidinium thiocyanate 25mM Sodium citrate pH 7 5% Sarkosyl 0,1M 2 - Mercaptol ethanol Dung dịch Trizol: Phenol pH4 380ml/l
Guanidine isothiocyanate 179g/l Glycerol 50ml/l NaOAc 33ml/l - Mercaptol - Chloroform - Isopropanol - Ethanol 70% - Ethanol 99%
- DEPC-H2O (nước xử lý bằng Di Ethyl Pyro Carbonate)
Hĩa chất RT-PCR: dNTP, RT buffer 5X, Rnasin, DTT, MMLV, PCR buffer
10X, MgCl2 25mM, Taq polymerase
Hĩa chất điện di
- TAE 1X (Tris Acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH8)
- Agarose
- Ethidium bromide (10mg/ml)
- Loading dye (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyanol; 40% glycerol)
Bộ Kit NucleoSpin Extract dùng để tinh chế DNA (Amersham Pharmacia
Biotech Inc)
Bộ hĩa chất dùng giải trình tự gen ALFexpressTM AutoCycleTM Sequencing Kit
(Amersham Pharmacia Biotech Inc)
Các enzyme sử dụng trong tạo dịng
- EcoRV (Fermentas)
- Pfu DNA polymerase (Fermentas)
- Taq DNA polymerase (Fermentas)
- T4 DNA ligase (Fermentas)
Thang DNA:
3.1.2. Mơi trường
- Mơi trường LB (Luria - Bertani) dùng để nuơi cấy E. coli cĩ thành phần như sau:
Hình 5Sơ đồ plasmid pBluescript II SK (+)
Trypton 10g
Cao nấm men 5g
NaCl 5g
Nước cất 1000ml
- Mơi trường LB-Amp dùng để chọn lọc thể biến nạp E. coli: cĩ thành phần tương tự như mơi trường LB và được bổ sung thêm ampicillin với nồng độ 50 g/ml ở 40-45oC sau khi hấp khử trùng.
Trong trường hợp dùng để chọn lọc dịng dựa trên nguyên tắc bổ trợ , mơi