4.1.1. Tạo dịng E. coli DH5 mang đoạn gen 5’UTR
a) Thu nhận đoạn gen 5’UTR từ virus CSFV
Sử dụng RNA tổng số thu nhận từ mẫu bệnh phẩm nhiễm CSFV làm khuơn mẫu trong phản ứng RT-PCR bằng các mồi CS-R/CS-F đặc hiệu cho gen 5’UTR. Sản phẩm RT-PCR sau đĩ được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%. Kết quả được trình bày ở
hình 9.
Phản ứng RT-PCR cho sản phẩm cĩ kích thước 287bp khi so sánh với thang chuẩn 50bp. Như vậy, đoạn gen được thu nhận đúng là gen 5’UTR. Tiến hành hàng loạt phản ứng RT-PCR và tinh chế sản phẩm bằng bộ kit NucleoSpin Extract nhằm thu nhận một số lượng lớn đoạn gen 5’UTR tinh sạch phục vụ cho mục đích tạo dịng.
b) Chuẩn bị plasmid pBluescript II SK (+)
(i) Thu nhận plasmid pBluescript II SK (+)
Nhằm thu nhận một lượng lớn plasmid pBluescript II SK (+) phục vụ cho các thí nghiệm sau, chủng pBlue/DH5 được nuơi cấy và tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS-kiềm. Sau đĩ, plasmid được kiểm tra nồng độ cũng như độ tinh sạch bằng máy đo quang phổ DNA. Kết quả cho thấy plasmid thu được cĩ độ tinh sạch nằm trong khoảng giới hạn cho phép (1,8 –2,0), cĩ thể sử dụng cho những thí nghiệm sau này.
Bảng 3: Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của plasmid sau tách chiết
Mẫu Nồng độ( g/ l) OD260/280 pBluescript II SK (+) 5,5 1,850
(ii) Xử lý pBluescript bằng enzyme cắt giới hạn
Hình 9: Kết quả phản ứng RT-PCR
Nhằm chuẩn bị vector cho chiến lược tạo dịng đầu bằng, chúng tơi tiến hành cắt mở vịng plasmid pBluescript II SK (+) bằng enzyme tạo đầu bằng EcoRV. Plasmid pBluescript cĩ vị trí cắt giới hạn duy nhất của EcoRV trong vùng MCS nên sản phẩm sau khi cắt hồn tồn sẽ cĩ kích thước 2961bp. Kết quả phản ứng cắt được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với thang chuẩn -HindIII.
Plasmid pBluescript sau khi xử lý bằng EcoRV sẽ được thu nhận từ gel agarose tinh sạch bằng bộ kit NucleoSpin Extract và sử dụng cho phản ứng nối tiếp theo.
c) Biến nạp vector tái tổ hợp vàoE. coli DH5
Gen 5’UTR và plasmid đầu bằng đã chuẩn bị được nối nhờ hoạt động của enzyme
T4 DNA ligase. Sản phẩm nối được biến nạp vào E. coli DH5 với nhân tố chọn lọc là khả năng kháng ampicillin và màu sắc khuẩn lạc. Plasmid mang gen kháng ampicillin, do đĩ thể biến nạp cĩ chứa plasmid này sẽ cĩ khả năng phát triển trên mơi trường cĩ bổ sung ampicillin. Ngược lại, tế bào E. coli DH5 khơng mang plasmid sẽ khơng phát triển được trên mơi trường cĩ ampicillin. Bên cạnh đĩ, dựa vào khả năng phân cắt cơ chất X- gal của -galactosidase, cĩ thể chọn lọc sơ tuyển các thể biến nạp cĩ mang gen mục tiêu 5’UTR. Các thể biến nạp cĩ mang đoạn gen chèn sẽ khơng cĩ khả năng phân cắt X-gal do hiện tượng bổ trợ khơng xảy ra, khơng hình thành -galactosidase để phân cắt X-gal nên khuẩn lạc cĩ màu trắng. Ngược lại, sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. Các khuẩn lạc trắng được chọn để kiểm tra xác nhận sự hiện diện của vector tái tổ hợp.
4.1.2. Kiểm tra sự hiện diện của đoạn 5’UTR trong thể biến nạp
a) PCR khuẩn lạc
Sau sàng lọc xanh trắng chúng tơi tiến hành kiểm tra sự hiện diện của đoạn 5’UTR trong các thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc. Sinh khối tế bào từ các khuẩn lạc sơ chọn được thu nhận và phá màng bằng nhiệt. Sử dụng hỗn hợp dịch tế bào sau phá màng làm khuơn trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn 5’UTR. Thí nghiệm được tiến hành song song với một đối chứng dương là phản ứng PCR với khuơn là gen 5’UTR và một đối chứng âm là phản ứng PCR với khuơn mẫu là plasmid pBlue. Kết quả kiểm tra được trình bày trên hình 11.
Hình 10: Kết quả phản ứng mở vịng pBlue bằng EcoRV (1)Thang chuẩn - HindIII (2)pBluescript SK (+) sau tách chiết (3) pBlue./EcoRV
Kết quả kiểm tra cho thấy phản ứng PCR khuẩn lạc từ các thể biến nạp 1 (giếng 3), 2 (giếng 4), 3 (giếng 6), 4 (giếng 7) và 5 (giếng 8) cho sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước 287bp khi so với thang chuẩn (giếng 1) và đối chứng dương đoạn 5’UTR (giếng 2). Ngược lại, phản ứng PCR khuẩn lạc từ thể biến nạp 6 (giếng 9) là âm tính như đối chứng âm, phản ứng PCR từ plasmid pBluescript (giếng 5). Như vậy, các thể biến nạp 1, 2, 3, 4, và 5 cĩ mang gen 5’UTR. Chúng tơi tiếp tục tiến hành kiểm tra plasmid tái tổ hợp thu được từ các thể biến nạp này bằng phản ứng PCR với cặp mồi T3/T7.
b) Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi T3/T7
Cặp mồi T3/T7 được thiết kế sẽ bắt cặp đặc hiệu với hai vùng trình tự chuyên biệt T3/T7 promoter nằm ở hai đầu vùng MCS trên pBluescript II SK (+). Vì vậy, đoạn gen nằm giữa hai mồi này sẽ được khuếch đại cho sản phẩm PCR cĩ kích thước 160bp. Nếu plasmid cĩ mang đoạn gen chèn 5’UTR tại vị trí cắt hạn chế EcoRV nằm trong vùng MCS, nĩ cũng sẽ được khuếch đại cùng với đoạn gen trên plasmid và cho sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước của đoạn gen mục tiêu cùng với đoạn gen trên plasmid (287bp + 160bp). Nhờ vào đặc điểm này, chúng tơi tiến hành phản ứng PCR với DNA bản mẫu là những plasmid tái tổ hợp được tách từ các khuẩn lạc dự tuyển ở trên để khẳng định những tế bào này mang plasmid cĩ đoạn gen chèn.
Các plasmid này được dùng làm khuơn mẫu trong phản ứng PCR với cặp mồi T3/T7. Đồng thời, chúng tơi cũng thực hiện phản ứng PCR với DNA bản mẫu là plasmid pBluescript khơng mang đoạn gen chèn với cặp mồi T3/T7. Kết quả kiểm tra được trình bày ở hình 12.
Kết quả điện di cho thấy, plasmid từ thể biến nạp được sử dụng làm khuơn mẫu trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen 5’UTR CS-R/CS-F (giếng 3) cho sản phẩm cĩ kích thước bằng với kích thước của gen 5’UTR (287bp) (giếng 2). Đồng thời, khi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi T3/T7 (giếng 5) cho sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước 447bp. Ngược lại, khi sử dụng plasmid pBlue trong phản ứng PCR với cặp mồi CS-R/CS-F (giếng 4) khơng cho sản phẩm khuếch đại, với cặp mồi T3/T7 (giếng 6) cho sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước 160bp. Từ đĩ, cĩ thể kết luận các khuẩn lạc sơ tuyển là những khuẩn lạc mang đoạn gen mục tiêu 5’UTR. Như vậy, chúng tơi đã thành cơng trong việc tạo dịng E. coli DH5 mang gen 5’UTR. Plasmid tái tổ hợp pBlue mang
Hình11: Kiểm tra khuẩn
lạc dự tuyển mang gen 5’UTR bằng phương pháp PCR khuẩn lạc
1. Thang DNA 50bp
2. Gen 5'UTR
3-9. Sản phẩm PCR từ các thể biến nạp sơ tuyển
gen 5’UTR được ký hiệu là pB-5’UTR. Dịng E. coli DH5 mang plasmid tái tổ hợp được đặt tên là E. coli pB-5’UTR/DH5 . Các dịng tái tổ hợp này sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm sau.