4.3.1. Khảo sát các phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm
Mẫu dùng cho tách chiết chúng tơi sử dụng là mẫu hạch bạch huyết của heo nhiễm CSFV. RNA tổng số được tách theo hai phương pháp khác nhau, điện di quan sát kết quả, kiểm tra độ tinh sạch và xác định nồng độ bằng phương pháp đo mật độ quang (đo OD).
Kết quả thu được như sau:
Bảng 4: Phân tích độ tinh sạch bằng quang phổ hấp thu
Mẫu RNA OD260 OD280 OD260/OD280 Nồng độ RNA ( g/ l) Phương pháp 1 2,106 1,257 1,664 6,7835
Phương pháp 2 2,539 1,404 1,809 5,106
Kết quả cho thấy cả hai phương pháp đều thu nhận được RNA và cho nồng độ cao khi đo mật độ quang. Tuy nhiên ở phương pháp 1, RNA thu được cĩ độ tinh sạch khơng đạt yêu cầu (1,664 nhỏ hơn 1,8). Ngược lại, ở phương pháp 2, RNA tổng số thu được cĩ độ sạch đạt yêu cầu (1,809, nằm trong khoảng 1,8-2). Thêm vào đĩ, ở phương pháp 2 thời gian tách chiết ngắn hơn so với phương pháp 1. Do vậy chúng tơi chọn phương pháp 2 để tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm.
4.3.2. Thiết lập phản ứng RT-PCR
RNA tổng số thu nhận từ mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong phản ứng RT-PCR. Mẫu bệnh phẩm sử dụng là mẫu đã được kiểm định nhiễm virus CSFV bằng phương pháp ELISA. Phản ứng RT-PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho trình tự 5’UTR của CSFV theo quy trình sau:
RT 37oC - 60 phút 94oC - 10 phút PCR 94oC - 4 phút 94oC - 1 phút 55oC - 1 phút 30 chu kỳ 72oC - 1 phút 30 giây
72oC - 5 phút
Sản phẩm RT-PCR được điện di và phân tích trên gel agarose 2%. Kết quả thu được như sau (hình 15):
Như vậy, sau phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu, ở mẫu nhiễm CSFV (giếng 3), chúng tơi thu được đoạn DNA cĩ kích thước 287bp khi so với thang chuẩn (giếng 2). Đây cũng là kích thước đoạn 5’UTR của CSFV. Ngược lại, khơng thu được sản phẩm khuếch đại ở phản ứng RT-PCR với mẫu khơng nhiễm CSFV (giếng 1). Kết quả này cho phép kết luận rằng phản ứng RT-PCR của chúng tơi cho kết quả tốt. Chúng tơi tiếp tục tiến hành các khảo sát nhằm tối ưu phản ứng RT-PCR để phát hiện CSFV từ mẫu bệnh phẩm.
4.3.3. Khảo sát các thành phần trong phản ứng RT-PCR
a) Khảo sát các thành phần trong phản ứng RT
(i) Nồng độ MMLV
Thực hiện phản ứng RT với các mẫu thí nghiệm trong đĩ thành phần phản ứng khơng đổi, riêng nồng độ MMLV được khảo sát trong dãy nồng độ sau: 6,25; 5; 4; 3; 2; 1 U trong 20 l phản ứng. Thực hiện PCR và điện di, phân tích kết quả trên gel agarose. Kết quả khảo sát thu được như sau (hình 16):
Kết quả khảo sát cho thấy: Ở nồng độ MMLV sử dụng trong phản ứng là 6,25 U (giếng 2); 5 U (giếng 3) cho sản phẩm khuếch đại rõ, đẹp. Trong khi ở các nồng độ cịn lại tín hiệu mờ hơn so với hai nồng độ trên. Do vậy, chúng tơi chọn nồng độ MMLV sử dụng trong phản ứng là 5U (giếng 3) để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
Hình 16: Khảo sát nồng độ MMLV
Giếng 1: Thang DNA 50bp; Giếng 2: 6,25 U; Giếng 3: 5 U ; Giếng 4: 4 U; Giếng 5: 3 U; Giếng 6: 2 U; Giếng 7:1 U Hình 15: Thiết lập phản ứng RT-PCR. Giếng 1: RT-PCR từ mẫu khơng nhiễm CSFV;
Giếng 2: thang DNA chuẩn 50bp;
Giếng 3: RT-PCR từ mẫu nhiễm CSFV
(ii) Nồng độ mồi CSR
Nhằm khảo sát nồng độ mồi sử dụng trong phản ứng RT, chúng tơi thực hiện các phản ứng trong đĩ các thành phần khác khơng thay đổi, riêng nồng độ mồi sử dụng lần lượt thay đổi như sau: 1,25; 0,75; 0,5; 0,25; 0,05 pmol trong 20 l thể tích phản ứng. Kết quả khảo sát nồng độ mồi được trình bày trong (hình 17).
Kết quả cho thấy cả 5 nồng độ khảo sát đều cho tín hiệu khuếch đại rõ nét. Do vậy, nồng độ mồi sử dụng nhỏ nhất 0,05 pmol (giếng 6) được chọn sử dụng trong các bước khảo sát tiếp theo.
(iii) Nồng độ dNTP
dNTP giữ vai trị quan trọng phản ứng RT, thêm vào đĩ việc giảm thiểu nồng độ dNTP sử dụng trong phản ứng cĩ ý nghĩa kinh tế khi quy trình phát hiện được sử dụng trong thực tiễn kiểm tra, phát hiện bệnh dịch tả heo. Chúng tơi tiến hành pha lỗng và sử dụng dNTP ở các nồng độ 0,5; 0,1; 0,01; 10-3; 10-4 mM trong 20 l thể tích phản ứng. Kết quả thu được như sau (hình 18).
Kết quả cho thấy 5 nồng độ đều cho sản phẩm khuếch đại. Tuy nhiên, ở nồng độ10- 3mM (giếng 5) và 10-4mM (giếng 6) sản phẩm khuếch đại thu được ít, khơng rõ nét. Trong khi đĩ ở các nồng độ dNTP cịn lại, phản ứng RT-PCR cho sản phẩm khuếch đại rõ nét. Chúng tơi chọn sử dụng dNTP trong phản ứng với nồng độ 0,01mM (giếng 4) cho các bước khảo sát tiếp theo.
(iv) Nồng độ mẫu RNA
Nồng độ RNA sử dụng trong phản ứng RT cĩ ý nghĩa quyết định cho kết quả phát hiện. Bên cạnh đĩ, nồng độ RNA sử dụng trong phản ứng cũng cho biết độ nhạy của quy trình phát hiện. Chúng tơi tiến hành pha lỗng và sử dụng RNA mẫu ở các nồng độ 500 ng; 100ng; 10ng; 1ng; 100pg; 10pg; 1pg trong 20 l phản ứng. Kết quả được trình bày trong (hình 19).
Kết quả cho thấy: ở các nồng độ mẫu từ 500ng (giếng 2) đến 100pg (giếng 6) cho kết quả rõ nét. Ở nồng độ mẫu 10pg (giếng 7) phản ứng cho kết quả khơng rõ, nồng độ
Hình 18: Khảo sát nồng độ dNTP
Giếng 1: Thang DNA 50bp; 2: 0,5mM; 3: 0,1mM; 4: 0,01mM; 5: 10-3mM; 6:10-4mM
Hình 17: Khảo sát nồng độ mồi CSR
Giếng 1: Thang DNA 50bp; 2: 1,25 pmol; 3: 0,75 pmol; 4: 0,5 pmol; 5: 0,25 pmol; 6: 0,05 pmol
1pg (giếng 8) khơng cho sản phẩm khuếch đại. Như vậy, cĩ thể phát hiện được sự hiện diện của virus CSFV từ nồng độ mẫu ban đầu là 10pg.
b) Khảo sát các thành phần trong phản ứng PCR
(i) Nồng độ dNTP
Nồng độ dNTP được khảo sát ở các nồng độ: 1; 0,5; 0,1; 0,01; 10-3; 10-4; 10-5 mM trong 25 l thể tích phản ứng. Kết quả thu được như sau:
Kết quả cho thấy ở tất cả các nồng độ khảo sát đều cho sản phẩm khuếch đại. Tuy nhiên, các nồng độ 10-3mM(giếng 6)đến 10-5 mM (giếng 8) cho kết quả khơng rõ nét. Chúng tơi chọn sử dụng dNTP với nồng độ 0,01mM (giếng 5) trong 25 l phản ứng PCR để tiếp tục thực hiện các khảo sát tiếp theo.
(ii) Nồng độ mồi
Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR được khảo sát ở các nồng độ 1; 0,25; 0,2; 0,08; 4.10-4 pmol trong 25 l thể tích phản ứng.
Kết quả cho thấy các nồng độ 1; 0,25; 0,2 pmol đều cho sản phẩm khuếch đại rõ nét. Ở nồng độ 4.10-4 pmol (giếng 6) khơng thấy dấu hiệu khuếch đại. Nồng độ 0,08 pmol (giếng 5) cho sản phẩm yếu. Chúng tơi chọn sử dụng cặp mồi CSR/CSF với nồng độ là 0,2 pmol (giếng 4) trong 25 l thể tích phản ứng để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
Hình 20: Khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng PCR. 1: Thang DNA 50bp; 2:1mM; 3: 0,5 mM; 4: 0,1 mM; 5: 0,01 mM; 6: 10-3 mM; 7: 10-4 mM; 8: 10-5 mM Hình 19:Khảo sát nồng độ mẫu 1: Thang DNA 50bp; 2: 500 ng; 3: 100 ng; 4: 10 ng; 5: 1ng; 6: 100 pg; 7: 10 pg; 8: 1 pg
Hình 23: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 1: Thang DNA 50bp 2: 50oC 3: 53oC 4: 55oC 5: 57oC 6: 60oC 7: 63oC 8: 65oC (iii) Nồng độ Mg2+
Mg2+ cĩ vai trị liên kết với dNTP, DNA và giúp Taq polymerase hoạt động. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động Taq polymerase bị ức chế, làm giảm số bản sao của sản phẩm cuối cùng.
Để chọn được nồng độ Mg2+ thích hợp sử dụng trong phản ứng PCR, chúng tơi tiến hành khảo sát dải nồng độ Mg2+ thay đổi từ 0-5 mM.
Kết quả cho thấy khi khơng cĩ Mg2+ (giếng 2) vẫn cĩ tín hiệu khuếch đại nhưng tín hiệu này yếu. Nồng độ Mg2+ chỉ cần rất nhỏ 0,5mM (giếng 3) đã cho tín hiệu khuếch đại rõ nét. Chúng tơi chọn nồng độ Mg2+ là 0,5 mM cho các bước khảo sát tiếp theo.
(iv) Nhiệt độ bắt cặp Hình 21:Khảo sát nồng độ mồi 1: Thang DNA 50bp 2: 1pmol 3: 0,25pmol 4: 0,2 pmol 5: 0,08pmol 6: 4.10-4 pmol
Hình 22:Khảo sát nồng độ Mg2+ Giếng 1: Thang DNA 50bp;
2: 0mM; 3: 0,5mM; 4: 1 mM; 5:1,5 mM; 6: 2 mM;7: 2,5 mM; 8: 3 mM; 9: 3,5 mM; 10: 4 mM; 11: 4,5 mM; 12: 5 mM
Nhiệt độ bắt cặp là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR. nhiệt độ bắt cặp quá thấp sẽ tạo những sản phẩm khuếch đại khơng đặc hiệu. Ngược lại nhiệt độ bắt cặp cao phản ứng cĩ thể sẽ khơng xảy ra. Do vậy, việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp để chọn được nhiệt độ thích hợp là rất cần thiết. Chúng tơi tiến hành thiết lập phản ứng PCR và đặt trương trình luân nhiệt với các nhiệt độ bắt cặp khác nhau như sau: 50; 53; 57; 60; 63; 65oC
Kết quả cho thấy ở nhiệt độ bắt cặp 65oC khơng thấy tín hiệu khuếch đại. Ở nhiệt độ 50; 60; 63 oC sản phẩm khuếch đại mờ so với nhiệt độ bắt cặp ở 53; 55; 57oC. Do vậy, chúng tơi chọn 57oC là nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR.
(v) Thời gian bắt cặp và thời gian kéo dài
Thời gian bắt cặp
Thời gian bắt cặp được khảo sát là: 1 phút; 45 giây; 30 giây.
Kết quả điện di cho thấy thời gian bắt cặp ở 1 phút (giếng 2) và 45 giây (giếng 3) cho tín hiệu rõ nét. Ởû nhiệt độ 30 giây sản phẩm khuếch đại mờ. Chúng tơi chọn 45 giây là thời gian bắt cặp sử dụng trong quy trình.
Thời gian kéo dài
Thời gian kéo dài được khảo sát là: 1 phút; 45 giây; 30 giây. Kết quả được trình