2.4.2.1 Nguyên lý
Nung chén nung ở t0 = 550 – 6000C đến trọng lượng khơng đổi, để nguội trong bình hút ẩm, cân trên cân phân tích 4 số lẻ.
2.4.2.2 Hố chất
- HNO3
2.4.2.3 Dụng cụ
- Chén nung bằng sứ hoặc kim loại (kền, bạch kim). - Lị nung điều chỉnh được nhiệt độ.
- Bếp điện hoặc đèn cồn. - Cân phân tích 4 số lẻ.
- Bình hút ẩm (với các hĩa chất hút ẩm là silicagen, CaCl2 khan, Na2SO4 khan).
2.4.2.4 Tiến hành
Cân khoảng 1g mẫu trong chén nung trên cân phân tích. Đốt từ từ mẫu trên bếp cĩ lĩt lưới amiang đến khi tạo thành tro đen. Sau đĩ cho mẫu vào lị nung và tăng dần nhiệt độđến 550 – 6000C. Nung đến tro trắng. Nếu cịn tro đen, lấy chén ra để nguội và cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3đậm đặc, rồi lại nung đến khi thành tro trắng. Nung đến trọng lượng khơng đổi, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân.
- 51 – Cơng thức tính tro tổng: Tt = 100 1 2 G G G G − − (%)
Trong đĩ: + G: khối lượng chén nung (g)
+ G1: khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g) + G2: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)
Hàm lượng tro (Tt) của mẫu được tính bằng cơng thức: Tt = 3 3 2 1 t t t T T T + + (%)
2..4.3. Phân tích thành phần acid amin
Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
2.4.3.1 Nguyên tắc
Thuỷ phân hồn tồn protein thành acid amin. Tạo dẫn xuất acid amin với PITC. Các dẫn xuất với PITC của acid amin phân tách tốt trên cột sắc ký C.18. Dựa vào thời gian lưu đặc trưng của mỗi loại acid amin để định tính. Dựa vào đường chuẩn được xây dựng từ các acid amin chuẩn đểđịnh lượng.
2.4.3.2 Dụng cụ
- Lị nhiệt - Cân phân tích
- Bình thuỷ phân làm bằng teflon - Bình định mức 10ml
- Thiết bị HPLC
2.4.3.3 Tiến hành
Phương pháp phân tích acid amin bằng HPLC cĩ các bước sau:
• Thủy phân protein và peptid cĩ trong mẫu.
• Sấy khơ mẫu.
• Thực hiện phản ứng chuyển hĩa PITC tạo dẫn xuất trước cột.
- 52 –
• Chạy sắc kí trên máy.
2.4.3.3.1. Thủy phân protein thành acid amin
Protein tinh khiết bị thủy phân bằng HCl 6N ở 110oC trong 24h (80-95% protein bị thủy phân).
2.4.3.3.2. Sấy khơ mẫu
Trong quá trình sấy khơ mẫu cĩ sử dụng dung dịch Ethanol:TEA:nước cất theo tỉ lệ 2:1:2. Sự cĩ mặt của TEA trong quá trình sấy khơ cĩ tác dụng trung hịa acid HCl dư cĩ trong mẫu sau thủy phân nhằm mục đích:
-Đảm bảo cho cột sắc kí khơng bị phá hỏng do cột sắc kí chỉ chịu được pH nằm trong khoảng 2.5-8.
-Tạo mơi trường kiềm cho phản ứng tạo dẫn xuất với PITC.
Ngồi ra TEA cịn giữ vai trị là chất phụ trợ xúc tác nhẹ cho quá trình sấy khơ mẫu diễn ra nhanh hơn
2.4.3.3.3. Phản ứng tao dẫn xuất trước cột PITC
Mục đích của quá trình là tạo ra những dẫn xuất của acid amin cĩ thể nhận biết được khi sử dụng đầu dị UV, UV detector chỉ phát hiện ra acid amin ở dạng dẫn xuất với PITC chứ khơng phát hiện được acid amin đơn thuần.
Lý do tạo dẫn xuất trước cột: trong trường hợp hĩa chất khơng nhạy đối với một detector (ở đây hĩa chất khơng đủ nhạy để sử dụng UV (detector))hoặc để tăng độ bền của chất cần phân tích hoặc để peak tách tốt hơn, người ta phải thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất để tạo ra dẫn xuất đáp ứng nhu cầu phân tích.
Kỹ thuật dẫn xuất trước cột: phản ứng chuyển hĩa được thực hiện trước khi mẫu phân đi vào cột sắc kí lỏng.
- 53 –
2.4.3.3.4. Pha dung dịch chuẩn:
Acid amin sẽ được định tính và định lượng dựa trên việc so sánh giữa mẫu và chuẩn dựa vào đường chuẩn của các acid amin.
2.4.3.3.5. Tiến hành chạy sắc kí:
-Cài đặt bước sĩng cho đầu dị. -Cài đặt chương trình chạy sắc kí.
-Chạy pha động trước cho đến khi đường nền ổn định. -Chạy chuẩn.
-Chạy mẫu.
2.4.3.4 Cơng thức tính
Hàm lượng mỗi acid amin trong mẫu phân tích được tính bằng số mg trong 1g mẫu bằng cơng thức . . .100 . M C S C V A S M =
- 54 –
A: nồng độ acid amin i, mg/g
SM: Diện tích peak acid amin i trên sắc ký đồ mẫu SC: Diện tích peak acid amin i trên sắc ký đồ chuẩn C: nồng độ acid amin chuẩn i tính theo đường chuẩn V: tổng thể tích định mức mẫu
M: khối lượng mẫu thực phẩm dùng để phân tích acid amin, g
2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng kim loại 2.4.4.1 Nguyên lý 2.4.4.1 Nguyên lý
Mẫu được sấy khơ, xử lý với HNO3 và hồ tan trong HCl, các thành phần kim loại được xác định bằng quang phổ phát xạ IPC.
2.4.4.2 Hố chất
-HNO3 - HCl
2.4.4.3 Dụng cụ
- Máy quang phổ phát xạ IPC - Micropipet
2.4.4.4 Tiến hành
- Cân 1g mẫu tiến hành tro hố 500 oC trong 2h và làm nguội. Nhỏ 10 giọt nước làm ẩm tro, thêm 3-4ml HNO3. Gia nhiệt 100-120 oC làm bay hơi HNO3. Sau đĩ tiếp tục tro hố 500 oC trong 1h. Làm nguội, hồ tan trong 10ml HCl, và định mức 50ml.
- Tiến hành đo mẫu trên máy quang phổ phát xạ. Tuỳ từng kim loại cần xác định sẽđo ở những bước sĩng khác nhau.
Bảng 2.3: Bước sĩng đo quang phổ phát xạứng với từng kim loại Kim loại Bước sĩng ( o A) Ca 3179 P 2149 Pb ---
- 55 – Zn 2138 Al --- Fe 2483 2.4.4.5 Cơng thức tính × × = kim lọai M (mg kg/ ) Cppm Vđm F m
Mkim loại : khối lượng kim loại (g)
Cppm: nồng độ dung dịch mẫu hiển thị trên máy. Vđm: thể tích dung dịch mẫu định mức (ml). F: hệ số pha lỗng.
m: lượng cân mẫu (g).
Việc phân tích thành phần axit amin và thành phần kim loại thực hiện tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm.
2.4.5. Phương pháp xác định phân tử lượng 2.4.5.1 Nguyên tắc 2.4.5.1 Nguyên tắc
Các dung dịch cao phân tử nồng độ lỗng thì cĩ mối liên hệ giữa độ nhớt và trọng lượng phân tử. Bằng cách đo độ nhớt η của dung dịch cao phân tử cĩ nồng độ C (g/100ml) và đo độ nhớt η0 của chất chuẩn là nước. Tìm bằng phương pháp đồ thị như sau: (η-η0) η0.C − = C 0 0 lim ] [ η η η η [η]
- 56 –
C
Sau đĩ dựa vào phương trình Standimger a
M k[ ] ]
[η = để tìm phân tử lượng trung bình M
Đối với gelatin acid, Jurad-Vene đã xác định được a= 0,74 và k=1,1. 4
10− Trong thực nghiệm thay thếη/η0 bằng Td/T0
2.4.5.2 Dụng cụ - Nhớt kế mao quản Ostwald - Đồng hố bấm giây - Bểđiều nhiệt - Ong bĩp cao su 2.4.5.2 Tiến hành
Pha dung dịch gelatin cĩ nồng độ giảm dần: 5%, 5/2%, 5/4%, 5/8%, 5/16%. Mỗi mẫu đo cần 20ml dung dịch. Dùng đồng hồ bấm giây đo thời gian chảy Td của mỗi dịch qua hai vạch của nhớt kế, đo 3lần mỗi dịch. Đo Tn của nước. Rửa cẩn thận sau mỗi lần đo. 2.4.5.3 Cơng thức tính Lập các tỷ lệ C T T T n n d − , vẽđồ thị biểu diễn C T T T n n d − =f(C) Tìm η theo hình và sau đĩ tính M =0.74 [ ] 4 10 1,10 η 2.4.6. Phương pháp xác định pH 2.4.6.1 Nguyên lý
Nguyên tắc chung của máy đo pH là suất điện động phát sinh trên mặt thủy tinh đồng nhất và cĩ cấu trúc giống nhau ở bên trong và bên ngồi điện cực thủy tinh cĩ điện cực cĩ khả năng trao đổi với ion H+, quá trình làm xuất hiện lớp điện tích kép trên bề mặt phân chia thủy tinh và dung dịch từ đĩ sẽ xuất hiện bước nhảy thế. Chính sức điện động xuất hiện bên trong và bên ngồi của điện cực chuyển sang thang đo pH.
- 57 –
Khi dùng máy đo pH cần phải tuân thủ các yêu cầu cơ bản của thiết bị. Lưu ý trước khi đo nên kiểm tra độ chính xác của máy bằng các dung dịch cĩ pH chuẩn.
2.4.6.2 Dụng cụ
- Máy đo pH hiệu Mettler Toledo - Becher 100ml, ống đong 25ml 2.4.6.3 Tiến hành
- Chuẩn bị dung dịch gelatin với nồng độ 6,67% (m/v) ( 0,5g Gelatin hồ tan trong 7ml nước) gia nhiệt 600C trong 1h. Đo pH ở nhiệt độ phịng.
- Sau mỗi lần đo phải dùng nước cất rửa sạch và lau khơ điện cực. - Đo lặp 3 lần
2.4.7. Phương pháp xác định độ nhớt 2.4.7.1 Nguyên lý 2.4.7.1 Nguyên lý
Nếu cho chất lỏng chảy qua các mao quản, chất lỏng càng cĩ độ nhớt cao chảy càng chậm vì vậy cĩ thể dựa vào tính chất đĩ để đo độ nhớt của chúng. Cá dung dịch keo và dung dịch cao phân tử thường cĩ độ nhớt cao. Độ nhớt của chúng phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ dung dịch. Độ nhớt tăng nếu hai yếu tố này tăng.
2.4.7.2 Dụng cụ - Nhớt kế mao quản Ostwald - Đồng hố bấm giây - Bểđiều nhiệt - Ong bĩp cao su 2.4.7.3 Tiến hành
- Đổ ngập dung dịch cần đo vào phần bầu của nhớt kế mao quản sao cho khơng cĩ bọt khí trong ống bầu. Dùng đồng hồ bấm giây để đo thời gian dung dịch chảy hết qua hai vạch của nhớt kế. Ghi nhận lại kết quả.
- Tiếp tục làm tương tự với nước cất ở cùng một nhiệt độ với dịch gelatin. - Rửa cẩn thận nhớt kế sau mỗi lần đo.
- 58 – 2.4.7.4 Cơng thức tính 0 0 µ τ τ µ = × Trong đĩ : µ : độ nhớt của dịch gelatin (cP). µ0 : độ nhớt của nước (cP).
τ : thời gian dịch gelatin chảy hết hai vạch của nhớt kế mao quản (s). τ0 : thời gian nước chảy hết hai vạch của nhớt kế mao quản (s).
2.4.8. Phương pháp xác định độđục 2.4.8. Dụng cụ 2.4.8. Dụng cụ
- Thiết bịđo quang phổ ( UV-1201 spectrophotometer) - Curvet
- Bểđiều nhiệt
2.4.8.2 Cách tiến hành
Chuẩn bị: Hồ tan Gelatin vào nước cất, đặt 60°C trong vịng 30 phút. Mẫu chuẩn: nước cất hai lần
Chuẩn bị các dung dịch Gelatin nồng độ: 2, 4, 6, 8, 10, 12 g/l
Cách đo: Độđục được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sĩng 660nm
2.4.9. Phương pháp xác định điểm đẳng điện pI 2.4.9.1 Nguyên lý 2.4.9.1 Nguyên lý
Dựa vào định nghĩa của điểm đẳng điện (pI): là giá trị pH của mơi trường mà tại đĩ các hạt phân tán khơng chuyển động trong điện trường. Do đĩ độ nhớt nhỏ nhất tại điểm đẳng điện pI.
2.4.9.2 Hố chất
- NaOH 1M
2.4.9.3 Dụng cụ
- 59 – - Nhớt kế mao quản Ostwald - Đồng hồ bấm giây. - Bểđiều nhiệt - Becher 100ml, ống đong 25ml, ống nhỏ giọt 1ml 2.4.9.3 Cách tiến hành
- Đo độ nhớt của dung dịch mẫu tương ứng khi pH mơi trường thay đổi từ 4-8 với bước 0,5. Thời gian dung dịch gelatin chảy trong nhớt kế mao quản sẽ ngắn nhất tại điểm pI. Nồng độ dung dịch gelatin 6,67%.
- Đo lặp 3 lần
2.4.10. Phương pháp xác định điểm tan chảy, điểm tạo gel 2.4.10.1 Nguyên lý 2.4.10.1 Nguyên lý
Dựa vào độ nhớt của dung dịch Gelatin: Nhiệt độ càng thấp độ nhớt càng cao, khi nhiệt độ thấp màng Gelatin bắt đầu được hình thành và dựa vào độ bền của màng để xác định được nhiệt độđiểm tạo gel và điểm tan chảy.
2.4.10..2 Hố chất - CCl4 2.4.10.3 Dụng cụ - Bểđiều nhiệt - Ong nghiệm - Đồng hồ bấm giây 2.4.10.4 Cách tiến hành
- Sử dụng dung dịch Gelatin 10%, được hồ tan trong ống nghiệm (15mmx178mm)
Thời gian Gelatin trưởng thành sau 12h ở 8-10°C Cách tiến hành:
- Xác định điểm tạo gel: Cho thay đổi nhiệt độ từ 50°C đến 8°C với tốc độ 0,5°C/phút.
- 60 –
- Điểm tan chảy tiến hành ngược lại (là nhiệt độ tại đĩ gel của gelatin đủ mềm để cho phép các giọt CCl4 chìm xuống. 2.4.11. Phương pháp xác định khả năng tạo gel 2.4.11.1 Dụng cụ - Máy đo cấu trúc INSTRON - Bể điều nhiệt - Becher 100ml, hộp petri 2.4.11.2 Tiến hành - Khởi động máy - Khởi động chương trình
Các bước khởi động và cài đặt chương trình phần mềm đo máy cấu trúc Instron 1. Nhấn TEST METHOD
2. Chọn file lưu trữ 3. Nhấn Next
4. Cài đặt các thơng số cần đo và tên mẫu xong sau đĩ nhấn Next 5. Nhấn Reset+ Nhấn Balance+ Nhấn Start bắt đầu đo
6. Đo xong nhấn Ok 7. Đo lặp nhấn Next
8. Đặt tên mẫu xong nhấn Next
9. Nhấn Reset+ Nhấn Balance+ Nhấn Start bắt đầu đo
10.Tiến hành đo mẫu mới nhấn Bullein và quá trình tiến hành lặp lại như trên
2.4.12. Phương pháp xác định ảnh hưởng nồng độđến tính chất keo gelatin 2.4.12.1 Anh hưởng nồng độđến độ nhớt
2.4.12.1.1 Dụng cụ
- Bểđiều nhiệt - Becher 100ml
- 61 –
- Nhớt kế mao quản Ostwald
2.4.12.1.2 Tiến hành
-Đo bằng nhớt kế mao quản Ostwald cách tiến hành phương pháp đo độ nhớt. -Khảo sát ảnh hưởng của nồng độđến độ nhớt bằng cách cho thay đổi nồng độ từ 3,333-10,000%. Phương pháp tạo gel tương tự (1)
2.4.12.2 Anh hưởng nồng độđến độ bền gel 2.4.12.2.1 Dụng cụ 2.4.12.2.1 Dụng cụ
- Máy đo cấu trúc INSTRON - Becher 100ml, hộp petri
2.4.12.2.2 Tiến hành
- Phương pháp tạo gel như bước 2 - Đo với máy đo cấu trúc INSTRON
2.4.13. Phương pháp xác định ảnh hưởng pH đến tính chất keo gelatin 2.4.13.1 Hố chất
- Đệm photphat – citrat 2.4.13.2 Dụng cụ
- Máy đo cấu trúc INSTRON - Máy đo pH hiệu Mettler Toledo - Bể điều nhiệt
- Becher 100ml, petri
2.4.13.3 Phương pháp tiến hành
Dung dịch đệm cĩ pH từ 3 – 7 dùng trong thí nghiệm là đệm photphat – citrat nên cĩ thể dùng trong các sản phẩm thực phẩm. Tiến hành các thí nghiệm để kiểm tra các thơng sốđã chọn, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần rồi lấy giá trị trung bình.
- 62 –
Loạt thí nghiệm : giữ thời gian gia nhiệt, thời gian trưởng thành, nồng độ 6,67% khơng đổi; thay đổi pH từ 3– 7; đo độ nhớt, pH của dung dịch gelatin trước thời gian trưởng thành và “độ bền gel” của các khối gel tạo thành.
Quá trình tạo gel như bước 2
2.4.14. Phương pháp xác định thời gian gel trưởng thành đến tính chất gelatin 2.4.14.1 Dụng cụ - Máy đo cấu trúc INSTRON - Bể điều nhiệt - Becher 100ml, petri 2.4.14.2 Cách tiến hành
Giữ nhiệt độ gia nhiệt, nồng độ 6,67% khơng đổi, thay đổi thời gian gel trưởng thành. 2.4.15. Phương pháp xác định tính năng tạo bọt 2.4.15.1 Dụng cụ - Thiết bị đồng hố - Ong đong 250ml - Bểđiều nhiệt - Đồng hồ bấm giây 2.4.15.2 Tiến hành
- 1g mẫu được hồ tan và trương nở trong 29ml nước cất.
- Mẫu được hồ tan ở 600C. Tạo bot bằng cách đồng hố 10000 rpm trong vịng 5 phút
- Dung dịch đồng nhất được đổ vào khuơn 250ml
- Khả năng tạo bọt được tính bằng thể tích của bọt lỏng.Độ bền của bọt được tính bằng thể tích bọt ban đầu và thể tích bọt sau 30 phút
- 63 –
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ