- Bước 1: Xác định thành phần hố học của nguyên liệu: ẩm, tro, thành phần acid amin, thành phần kim loại.
- 47 –
- Bước 2: Khảo sát tính chất của dung dịch gelatin – nước: độ nhớt, độ đục, điểm tan chảy, điểm tạo gel, pH, độđục, phân tử lượng.
- Bước 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên tính năng tạo gel: nồng độ, pH, thời gian trưởng thành đến tính chất gelatin da cá.
- Bước 4: Khảo sát tính năng cơng nghệ của gelatin da cá: khả năng tạo bọt. Các bước tiến hành đều thực hiện cĩ sự đối chứng giữa mẫu gelatin da cá và các mẫu gelatin khác.
2.3.2 Thuyết minh tiến trình thí nghiệm
Bước 1
a. Mục đích:
Xác định các thành phần hố học cơ bản của nguyên liệu b. Phương pháp thực hiện:
Các thơng số kiểm tra: ẩm, tro, thành phần acid amin, hàm lượng kim loại. Bước 2:
a. Mục đích:
Xác định các tính chất hố lý của mẫu gelatin: độ nhớt, độđục, điểm tan chảy, điểm tạo gel, pH, phân tử lượng.
b. Phương pháp thực hiện:
ü Phương pháp tạo dung dịch:
Cân x (g) gelatin vào y (ml) nước cất, khuấy đảo nhẹ rồi để yên trong 30 phút cho trương nởở nhiệt độ phịng.
Sau đĩ cho vào bể điều nhiệt ở 600C trong 60 phút để hồ tan gelatin, cĩ khuấy đảo gián đoạn. Dung dịch thu được dùng để đo pH, độ nhớt, điểm tan chảy, điểm tạo gel, độđục.
ü Phương pháp tạo gel: dung dịch gelatin sau khi đã hồ tan sẽ được làm nguội và giữ ổn định ở nhiệt độ 8 – 100C trong khoảng thời gian t. Thời gian này gọi là thời gian trưởng thành. Khối gel thu được sẽđược đem xác định “độ bền gel”.
- 48 –
Khối gel được hình thành sau thời gian t sẽ được cho vào bể điều nhiệt ở 600C nhằm tan chảy ra lại, thu được dung dịch gelatin sau thời gian trưởng thành. Dung dịch thu được sẽđo pH, độ nhớt, điểm tan chảy.
ü Phương pháp tạo màng: dung dịch gelatin được tạo thành theo phương pháp trên. Sau đĩ tạo màng bằng cách trải đều một lượng dung dịch gelatin nhất định lên một diện tích xác định. Màng tạo thành sẽđo khả năng chịu lực của màng.
ü Thơng số kiểm tra: pH, độ nhớt của dung dịch gelatin trước và sau thời gian trưởng thành; “độ bền gel” của khối gel.
Bước 3
a. Mục đích:
Tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền gel của gelatin da cá và so sánh với các mẫu gelatin trên thị trường.
+ Tìm giá trị nồng độ tạo gel tốt nhất từ đĩ xác định độ Bloom của gelatin mẫu thí nghiệm.
+ Anh hưởng của pH đến tính chất của dung dịch gelatin. Vì lý do các sản phẩm thực phẩm thường chỉ cĩ các giá trị pH trong khoảng 3 -7, nên tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các giá trị pH trong khoảng này đến tính chất của dung dịch gelatin.
+ Xác định thời gian gel trưởng thành mà tại đĩ giá trịđộ bền gel lớn nhất. b. Phương pháp thực hiện:
• Anh hưởng của nồng độđến tính chất gelatin
Các thơng số biến đổi: nồng độ gelatin trong nước từ 3,335% đến 10,005% cho các thí nghiệm vềđộ nhớt, “độ bền gel”. Lí do khảo sát vùng nồng độ này là vì đây là khoảng nồng độ thường được dùng trong các sản phẩm thực phẩm và nồng độ 6,67% là nồng độ chuẩn dùng để kiểm tra các tính chất của dung dịch gelatin.
Các mẫu thí nghiệm sẽđược kiểm tra độ nhớt, pH, “độ bền gel”.
• Anh hưởng của pH dung dịch đệm đến tính chất gelatin
Dung dịch đệm cĩ pH từ 3 – 7 dùng trong thí nghiệm là đệm photphat – citrat nên cĩ thể dùng trong các sản phẩm thực phẩm. Tiến hành thực nghiệm để kiểm tra các thơng sốđã chọn, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần rồi lấy giá trị trung bình.
- 49 –
Bố trí thí nghiệm: giữ thời gian gia nhiệt, thời gian trưởng thành, nồng độ 6,67% khơng đổi; thay đổi pH từ 3– 7; đo độ nhớt, pH của dung dịch gelatin trước thời gian trưởng thành và “độ bền gel” của các khối gel tạo thành.
+ Anh hưởng của thời gian trưởng thành đến độ bền gel của gelatin
Bố trí thí nghiệm: giữ thời gian gia nhiệt, nồng độ 6,67% khơng đổi, thay đổi thời gian trưởng thành và đo “độ bền gel” của các khối gel tạo thành.
Quá trình chuẩn bị dung dịch gel và tạo gel thực hiện tương tự nhưở bước 2.
Bước 4:
a. Mục đích:
Khảo sát các tính năng cơng nghệ của gelatin: khả năng tạo bọt. b. Phương pháp thực hiện:
Phương pháp tạo dung dịch: nhưở bước 2 Chuẩn bị: Dung dịch nồng độ từ 2-12g/l
2.4 Phương pháp phân tích [ 1, AOAC]
2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng ẩm 2.4.1.1 Nguyên lý 2.4.1.1 Nguyên lý
Xác định ẩm nguyên liệu bằng máy đo ẩm Scaltec SMO 01.
Nguyên tắc hoạt động của máy đo độẩm nĩi chung dựa trên 3 bộ phận chính: - Nguồn nhiệt để sấy và tách ẩm.
- Cân phân tích và xác định khối lượng. - Bộ phận xử lý số liệu và điều khiển.
Quá trình sấy sẽ dừng nếu sự thay đổi về khối lượng là khơng đáng kể (bước nhảy khối lượng khơng đáng kể là bao nhiêu tùy vào sự cài đặt và độ nhạy của cân), hoặc theo sự cài đặt thời gian. Số liệu thu được cĩ thể là khối lượng, hàm lượng ẩm, hàm lượng chất khơ v.v….
2.4.1.2 Dụng cụ
- 50 –
- Máy đo ẩm tựđộng
2.4.1.3 Tiến hành
Khi sử dụng máy đo độ ẩm, tùy loại máy cụ thể, các thao tác thực hiện cĩ thể khác nhau, nhưng nĩi chung gồm 3 thao tác chính:
- Khởi động máy.
- Điều chỉnh chế độ đo: tự động dừng hay theo thời gian, nhiệt độ, thời gian sấy, kiểu giá trị hiển thị (khối lượng, hàm lượng…).
- Đo và ghi nhận kết quả.
2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng 2.4.2.1 Nguyên lý 2.4.2.1 Nguyên lý
Nung chén nung ở t0 = 550 – 6000C đến trọng lượng khơng đổi, để nguội trong bình hút ẩm, cân trên cân phân tích 4 số lẻ.
2.4.2.2 Hố chất
- HNO3
2.4.2.3 Dụng cụ
- Chén nung bằng sứ hoặc kim loại (kền, bạch kim). - Lị nung điều chỉnh được nhiệt độ.
- Bếp điện hoặc đèn cồn. - Cân phân tích 4 số lẻ.
- Bình hút ẩm (với các hĩa chất hút ẩm là silicagen, CaCl2 khan, Na2SO4 khan).
2.4.2.4 Tiến hành
Cân khoảng 1g mẫu trong chén nung trên cân phân tích. Đốt từ từ mẫu trên bếp cĩ lĩt lưới amiang đến khi tạo thành tro đen. Sau đĩ cho mẫu vào lị nung và tăng dần nhiệt độđến 550 – 6000C. Nung đến tro trắng. Nếu cịn tro đen, lấy chén ra để nguội và cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3đậm đặc, rồi lại nung đến khi thành tro trắng. Nung đến trọng lượng khơng đổi, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân.
- 51 – Cơng thức tính tro tổng: Tt = 100 1 2 G G G G − − (%)
Trong đĩ: + G: khối lượng chén nung (g)
+ G1: khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g) + G2: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)
Hàm lượng tro (Tt) của mẫu được tính bằng cơng thức: Tt = 3 3 2 1 t t t T T T + + (%)
2..4.3. Phân tích thành phần acid amin
Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp
2.4.3.1 Nguyên tắc
Thuỷ phân hồn tồn protein thành acid amin. Tạo dẫn xuất acid amin với PITC. Các dẫn xuất với PITC của acid amin phân tách tốt trên cột sắc ký C.18. Dựa vào thời gian lưu đặc trưng của mỗi loại acid amin để định tính. Dựa vào đường chuẩn được xây dựng từ các acid amin chuẩn đểđịnh lượng.
2.4.3.2 Dụng cụ
- Lị nhiệt - Cân phân tích
- Bình thuỷ phân làm bằng teflon - Bình định mức 10ml
- Thiết bị HPLC
2.4.3.3 Tiến hành
Phương pháp phân tích acid amin bằng HPLC cĩ các bước sau:
• Thủy phân protein và peptid cĩ trong mẫu.
• Sấy khơ mẫu.
• Thực hiện phản ứng chuyển hĩa PITC tạo dẫn xuất trước cột.
- 52 –
• Chạy sắc kí trên máy.
2.4.3.3.1. Thủy phân protein thành acid amin
Protein tinh khiết bị thủy phân bằng HCl 6N ở 110oC trong 24h (80-95% protein bị thủy phân).
2.4.3.3.2. Sấy khơ mẫu
Trong quá trình sấy khơ mẫu cĩ sử dụng dung dịch Ethanol:TEA:nước cất theo tỉ lệ 2:1:2. Sự cĩ mặt của TEA trong quá trình sấy khơ cĩ tác dụng trung hịa acid HCl dư cĩ trong mẫu sau thủy phân nhằm mục đích:
-Đảm bảo cho cột sắc kí khơng bị phá hỏng do cột sắc kí chỉ chịu được pH nằm trong khoảng 2.5-8.
-Tạo mơi trường kiềm cho phản ứng tạo dẫn xuất với PITC.
Ngồi ra TEA cịn giữ vai trị là chất phụ trợ xúc tác nhẹ cho quá trình sấy khơ mẫu diễn ra nhanh hơn
2.4.3.3.3. Phản ứng tao dẫn xuất trước cột PITC
Mục đích của quá trình là tạo ra những dẫn xuất của acid amin cĩ thể nhận biết được khi sử dụng đầu dị UV, UV detector chỉ phát hiện ra acid amin ở dạng dẫn xuất với PITC chứ khơng phát hiện được acid amin đơn thuần.
Lý do tạo dẫn xuất trước cột: trong trường hợp hĩa chất khơng nhạy đối với một detector (ở đây hĩa chất khơng đủ nhạy để sử dụng UV (detector))hoặc để tăng độ bền của chất cần phân tích hoặc để peak tách tốt hơn, người ta phải thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất để tạo ra dẫn xuất đáp ứng nhu cầu phân tích.
Kỹ thuật dẫn xuất trước cột: phản ứng chuyển hĩa được thực hiện trước khi mẫu phân đi vào cột sắc kí lỏng.
- 53 –
2.4.3.3.4. Pha dung dịch chuẩn:
Acid amin sẽ được định tính và định lượng dựa trên việc so sánh giữa mẫu và chuẩn dựa vào đường chuẩn của các acid amin.
2.4.3.3.5. Tiến hành chạy sắc kí:
-Cài đặt bước sĩng cho đầu dị. -Cài đặt chương trình chạy sắc kí.
-Chạy pha động trước cho đến khi đường nền ổn định. -Chạy chuẩn.
-Chạy mẫu.
2.4.3.4 Cơng thức tính
Hàm lượng mỗi acid amin trong mẫu phân tích được tính bằng số mg trong 1g mẫu bằng cơng thức . . .100 . M C S C V A S M =
- 54 –
A: nồng độ acid amin i, mg/g
SM: Diện tích peak acid amin i trên sắc ký đồ mẫu SC: Diện tích peak acid amin i trên sắc ký đồ chuẩn C: nồng độ acid amin chuẩn i tính theo đường chuẩn V: tổng thể tích định mức mẫu
M: khối lượng mẫu thực phẩm dùng để phân tích acid amin, g
2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng kim loại 2.4.4.1 Nguyên lý 2.4.4.1 Nguyên lý
Mẫu được sấy khơ, xử lý với HNO3 và hồ tan trong HCl, các thành phần kim loại được xác định bằng quang phổ phát xạ IPC.
2.4.4.2 Hố chất
-HNO3 - HCl
2.4.4.3 Dụng cụ
- Máy quang phổ phát xạ IPC - Micropipet
2.4.4.4 Tiến hành
- Cân 1g mẫu tiến hành tro hố 500 oC trong 2h và làm nguội. Nhỏ 10 giọt nước làm ẩm tro, thêm 3-4ml HNO3. Gia nhiệt 100-120 oC làm bay hơi HNO3. Sau đĩ tiếp tục tro hố 500 oC trong 1h. Làm nguội, hồ tan trong 10ml HCl, và định mức 50ml.
- Tiến hành đo mẫu trên máy quang phổ phát xạ. Tuỳ từng kim loại cần xác định sẽđo ở những bước sĩng khác nhau.
Bảng 2.3: Bước sĩng đo quang phổ phát xạứng với từng kim loại Kim loại Bước sĩng ( o A) Ca 3179 P 2149 Pb ---
- 55 – Zn 2138 Al --- Fe 2483 2.4.4.5 Cơng thức tính × × = kim lọai M (mg kg/ ) Cppm Vđm F m
Mkim loại : khối lượng kim loại (g)
Cppm: nồng độ dung dịch mẫu hiển thị trên máy. Vđm: thể tích dung dịch mẫu định mức (ml). F: hệ số pha lỗng.
m: lượng cân mẫu (g).
Việc phân tích thành phần axit amin và thành phần kim loại thực hiện tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm.
2.4.5. Phương pháp xác định phân tử lượng 2.4.5.1 Nguyên tắc 2.4.5.1 Nguyên tắc
Các dung dịch cao phân tử nồng độ lỗng thì cĩ mối liên hệ giữa độ nhớt và trọng lượng phân tử. Bằng cách đo độ nhớt η của dung dịch cao phân tử cĩ nồng độ C (g/100ml) và đo độ nhớt η0 của chất chuẩn là nước. Tìm bằng phương pháp đồ thị như sau: (η-η0) η0.C − = C 0 0 lim ] [ η η η η [η]
- 56 –
C
Sau đĩ dựa vào phương trình Standimger a
M k[ ] ]
[η = để tìm phân tử lượng trung bình M
Đối với gelatin acid, Jurad-Vene đã xác định được a= 0,74 và k=1,1. 4
10− Trong thực nghiệm thay thếη/η0 bằng Td/T0
2.4.5.2 Dụng cụ - Nhớt kế mao quản Ostwald - Đồng hố bấm giây - Bểđiều nhiệt - Ong bĩp cao su 2.4.5.2 Tiến hành
Pha dung dịch gelatin cĩ nồng độ giảm dần: 5%, 5/2%, 5/4%, 5/8%, 5/16%. Mỗi mẫu đo cần 20ml dung dịch. Dùng đồng hồ bấm giây đo thời gian chảy Td của mỗi dịch qua hai vạch của nhớt kế, đo 3lần mỗi dịch. Đo Tn của nước. Rửa cẩn thận sau mỗi lần đo. 2.4.5.3 Cơng thức tính Lập các tỷ lệ C T T T n n d − , vẽđồ thị biểu diễn C T T T n n d − =f(C) Tìm η theo hình và sau đĩ tính M =0.74 [ ] 4 10 1,10 η 2.4.6. Phương pháp xác định pH 2.4.6.1 Nguyên lý
Nguyên tắc chung của máy đo pH là suất điện động phát sinh trên mặt thủy tinh đồng nhất và cĩ cấu trúc giống nhau ở bên trong và bên ngồi điện cực thủy tinh cĩ điện cực cĩ khả năng trao đổi với ion H+, quá trình làm xuất hiện lớp điện tích kép trên bề mặt phân chia thủy tinh và dung dịch từ đĩ sẽ xuất hiện bước nhảy thế. Chính sức điện động xuất hiện bên trong và bên ngồi của điện cực chuyển sang thang đo pH.
- 57 –
Khi dùng máy đo pH cần phải tuân thủ các yêu cầu cơ bản của thiết bị. Lưu ý trước khi đo nên kiểm tra độ chính xác của máy bằng các dung dịch cĩ pH chuẩn.
2.4.6.2 Dụng cụ
- Máy đo pH hiệu Mettler Toledo - Becher 100ml, ống đong 25ml 2.4.6.3 Tiến hành
- Chuẩn bị dung dịch gelatin với nồng độ 6,67% (m/v) ( 0,5g Gelatin hồ tan trong 7ml nước) gia nhiệt 600C trong 1h. Đo pH ở nhiệt độ phịng.
- Sau mỗi lần đo phải dùng nước cất rửa sạch và lau khơ điện cực. - Đo lặp 3 lần
2.4.7. Phương pháp xác định độ nhớt 2.4.7.1 Nguyên lý 2.4.7.1 Nguyên lý
Nếu cho chất lỏng chảy qua các mao quản, chất lỏng càng cĩ độ nhớt cao chảy càng chậm vì vậy cĩ thể dựa vào tính chất đĩ để đo độ nhớt của chúng. Cá dung dịch keo và dung dịch cao phân tử thường cĩ độ nhớt cao. Độ nhớt của chúng phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ dung dịch. Độ nhớt tăng nếu hai yếu tố này tăng.
2.4.7.2 Dụng cụ - Nhớt kế mao quản Ostwald - Đồng hố bấm giây - Bểđiều nhiệt - Ong bĩp cao su 2.4.7.3 Tiến hành
- Đổ ngập dung dịch cần đo vào phần bầu của nhớt kế mao quản sao cho khơng cĩ bọt khí trong ống bầu. Dùng đồng hồ bấm giây để đo thời gian dung dịch chảy hết qua hai vạch của nhớt kế. Ghi nhận lại kết quả.
- Tiếp tục làm tương tự với nước cất ở cùng một nhiệt độ với dịch gelatin. - Rửa cẩn thận nhớt kế sau mỗi lần đo.
- 58 – 2.4.7.4 Cơng thức tính 0 0 µ