3.2.4.1. Đánh giá khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn
- Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự:
- Làm tươi chủng:
- Lấy 1 lượng sinh khối nhỏ chuyển sang lọ penicillin có chứa 3ml môi trường LB. Đem đi nuôi lắc ở 180 vòng/phút ở 30o
C
- Sau 24 giờ thu dịch đem đi đo OD ở bước sóng 600nm - Pha loãng để đạt đươc OD= 0,3
40
- Hút 1% dịch trên vào các eppendorf chứa 300µl dịch LB (số lượng eppendorf = số ngày thử nghiệm x số chủng x 3)
- Sau 1, 2, 3 ngày lấy ra để kiểm tra khả năng tạo màng biofilm của các chủng.
Thử khả năng tạo màng biofilm (theo phương pháp của Morikawa và cs, 2006)
- Dùng pipet hút dịch nuôi cấy từ eppendorf ra nhè nhẹ (không làm vỡ màng) - Bơm 500µl nước cất vào eppendorf và hút ra nhè nhẹ (lặp lại lần nữa)
- Bơm 300µl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào eppendorf, đợi 10 phút để cố định - Hút dịch tím tinh thể ra, rửa bằng nước cất (2 lần)
- Bơm 300µl acid acetic 33% vào eppendorf, đi vortex - Pha loãng và đo OD ở bước sóng 570nm
- Các ngày thí nghiệm sau thực hiện giống nhau.
3.2.4.2. Tách chiết, phân tích đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon
Các chủng vi khuẩn và nấm men được nuôi tĩnh trên môi trường hiếu khí tổng số để tạo màng sinh học. Sau 48h, dịch nuôi cấy được hút nhẹ nhàng ra khỏi bình nuôi cấy, tránh làm vỡ màng. Rửa màng bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó, bổ sung môi trường muối khoáng nghèo dinh dưỡng và 2% dầu diesel. Sau 5 ngày nuôi tĩnh, dịch nuôi cấy được phân tích để xác định hàm lượng dầu còn lại bằng cách lấy toàn bộ dịch nuôi cấy ra, tách chiết bằng dung môi hữu cơ: aceton (1:3), ethyl acetate (chiết 3 lần). Dịch tách chiết được đem đi phân tích hóa học trên các máy sắc kí như sắc kí khí (GC), sắc kí khí khối phổ (GCMS) hoặc phân tích dầu tổng số nhằm đánh giá khả năng phân hủy và chuyển hóa các thành phần hydrocarbon của màng đa chủng thu được. Phân tích khả năng phân hủy dầu diesel được thực hiện với sự phối hợp của Viện Hóa công nghiệp, Bộ Công thương.
Qui trình chuẩn bị mẫu để phân tích các thành phần có trong dầu FO trên cơ sở phương pháp US EPA method 610:
Lấy 60ml CH2Cl2 cho vào 500ml nước thải đựng trong phễu chiết, lắc đều, để lắng chờ hỗn hợp tách thành hai pha. Tách pha CH2Cl2 (bên dưới) ra.
Tiếp tục thêm 60ml CH2Cl2 vào pha nước, làm tương tự như trên (chiết 3 lần). Gom toàn bộ dịch chiết CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4, lọc, cô quay dung môi dưới áp suất giảm đến khi còn 10ml.
Cho dịch chiết này qua cột chiết pha rắn florisil, rửa giải bằng 3ml n-hexan Hút 1ml dịch n-hexan đi phân tích GC/MS. Bơm 0.2µl mẫu vào máy GCMS Máy hệ GCMS Agilent 6980-5973N. Cột sử dụng phân tích là HP-5MS. Chương trình nhiệt độ 50 - (3 phút) - 80- (8 phút) - 200 (15 phút) - 250 (7 phút).
41
3.2.4.3. Thuyết minh chi tiết quy trình
Bước 1:
Lựa chọn các chủng vi khuẩn và nấm men sạch có khả năng tạo màng và chất hoạt động bề mặt tốt, ổn định (theo mục V.I, V.II).
Sinh khối vi khuẩn được nhân lên trong 50ml môi trường LB dịch và sinh khối nấm men được nhân lên trong 50ml môi trường Hansen dịch trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở 22-30oC trong 24 giờ.
Bước 2:
Sau 24 giờ, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút/4oC (vi khuẩn) hoặc 6000 vòng/phút/4oC (nấm men) trong 10 phút để thu sinh khối. Rửa bằng nước cất 2 lần.
Bước 3:
Hòa tan sinh khối bằng nước cất, đo OD600 và tính toán sao cho OD600 = 0,3. Bổ sung 4,5 lít môi trường LB dịch (đối với vi khuẩn) và 4,5 lít môi trường Hansen dịch (đối với nấm men) vào bình thủy tinh kích thước: 16 x 20 x 3,14 (cm2).
Bước 4:
Để tĩnh trong 24 - 72 giờ sao cho trên bề mặt bình thủy tinh xuất hiện lớp màng vi sinh vật.
Bước 5:
Dùng pipet thủy tinh hút nhẹ dịch ở dưới màng và rửa sạch màng bằng nước cất 2 lần.
Bước 6:
Bổ sung 5 lít môi trường Gost + vitamin. Tùy vào mục đích xử lý các thành phần dầu mỏ (DO, FO, hydrocarbon thơm,…) mà bổ sung các cơ chất này theo tỉ lệ thích hợp. Cụ thể: Dầu FO: 0,1-1%; Dầu DO: 1-2%; hydrocarbon thơm: 150ppm.
Bước 7:
Nuôi tĩnh sau 5, 7, 14 ngày rút mẫu ra và chiết với (1:3), ethyl acetate (chiết 3 lần) rồi mang mẫu đi phân tích sắc ký để đánh giá hiệu quả xử lý các thành phần trên.
Một số hình ảnh minh họa trong quá trình thực hiện quy trình tạo màng
(a) (b)
42
Hình 3.18. Cấu trúc hiển vi của biofilm tạo bởi các chủng vi khuẩn và cấu trúc những kênh dẫn nước cho phép dòng nước chảy qua
Hình 3.19. Ảnh hiển vi quét cho thấy cấu trúc không đồng đều bên trong biofilm tạo thành bởi các chủng nấm men
43
CHƯƠNG IV. Nội dung 4: Nghiên cứu hiệu quả xử lý các thành phần hydrocarbon no của biofilm đa chủng ở quy mô phòng thí nghiệm