3.2.1. Sơ đồ quy trình
3.2.2. Tiêu chuẩn nguyên – vật liệu đầu vào
Các chủng vi khuẩn và nấm men nghiên cứu được phân lập từ các mẫu bị ô nhiễm dầu có khả năng tạo màng và phân hủy các hợp chất hydrocarbon tốt: Rhodococcus sp. B2,
Bacillus sp. B8, Rhodococcus sp. B15, Rhodococcus sp. B16, Candida viswanathii
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
Nuôi trên môi trường LB/Hansen trên máy lắc 180 vòng/phút; 22-30oC; 24 giờ
Ly tâm thu sinh khối ở 4000 vòng/phút (vi khuẩn) hoặc 6000 vòng/phút (nấm men) trong 10 phút, rửa bằng nước cất 2 lần
Hòa tan sinh khối bằng nước cất, đo OD600, tính toán OD=0,3
Bổ sung 4,5 lít LB/Hansen và giống vào bình, nuôi 24-72h
Hút hết dịch và rửa màng bằng nước cất 2 lần Xuất hiện lớp màng sinh học
Hỗn hợp giống gốc (7) Bổ sung 5 lít Gost + 0,1-1% FO Bổ sung 5 lít Gost + 2-5% DO Bổ sung 5 lít Gost + 150ppm HC thơm (6)
5, 7, 14 ngày rút mẫu, xử lý và phân tích sắc ký
39
TH1, Candida tropicalis TH4 được giữ trên môi trường LB và Hansen thạch trong các lọ penicillin thạch nghiêng và được lưu giữ ở Phòng CNSH môi trường, Viện CNSH. Thành phần cụ thể của môi trường nhân giống được chỉ ra ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần môi trường nhân giống
Môi trường LB Môi trường Hansen
TT Hóa chất Khối lượng (g/L) TT Hóa chất Khối lượng (g/L)
1 NaCl 10 1 K2HPO4 3
2 Tryptone 10 2 NaCl 5
3 Cao men 5 3 MgCl2 1
4 Nước cất Tới 1 lít (pH 7-7,2) 4 MgSO4 2
Nước muối sinh lý 5 Glucose 50
1 NaCl 8,5 6 Peptone 10
2 Nước cất Tới 1 lít 7 Nước cất Tới 1 lít (pH 5,5) Môi trường xử lý là môi trường khoáng Gost: pH 5.5-8.5; nồng độ muối NaCl 0,5-2 %, nguồn cacbon: từ 2-5% dầu olive, rỉ đường, glycerol; nguồn nitơ: (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4.
Các môi trường được cân cẩn thận và được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
3.2.3. Các loại vật tư, thiết bị sử dụng
Các loại máy móc có độ chính xác cao của phòng Công nghệ Sinh học Môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm CN Gen, Viện Công nghệ Sinh học: máy khử trùng môi trường và vật tư; box cấy vô trùng; máy lắc 30oC, 37oC; tủ nuôi 30oC, 37oC; máy ly tâm, máy đo OD, bình tam giác; ống effendorf; lọ penicillin; các loại đầu côn 200µl, 1ml, 5ml; pipet thủy tinh; bình thủy tinh kích thước 25 x 20 x 3,14 (cm2), nước cất.
3.2.4. Phương pháp kiểm tra
3.2.4.1. Đánh giá khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn
- Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự:
- Làm tươi chủng:
- Lấy 1 lượng sinh khối nhỏ chuyển sang lọ penicillin có chứa 3ml môi trường LB. Đem đi nuôi lắc ở 180 vòng/phút ở 30o
C
- Sau 24 giờ thu dịch đem đi đo OD ở bước sóng 600nm - Pha loãng để đạt đươc OD= 0,3
40
- Hút 1% dịch trên vào các eppendorf chứa 300µl dịch LB (số lượng eppendorf = số ngày thử nghiệm x số chủng x 3)
- Sau 1, 2, 3 ngày lấy ra để kiểm tra khả năng tạo màng biofilm của các chủng.
Thử khả năng tạo màng biofilm (theo phương pháp của Morikawa và cs, 2006)
- Dùng pipet hút dịch nuôi cấy từ eppendorf ra nhè nhẹ (không làm vỡ màng) - Bơm 500µl nước cất vào eppendorf và hút ra nhè nhẹ (lặp lại lần nữa)
- Bơm 300µl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào eppendorf, đợi 10 phút để cố định - Hút dịch tím tinh thể ra, rửa bằng nước cất (2 lần)
- Bơm 300µl acid acetic 33% vào eppendorf, đi vortex - Pha loãng và đo OD ở bước sóng 570nm
- Các ngày thí nghiệm sau thực hiện giống nhau.
3.2.4.2. Tách chiết, phân tích đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon
Các chủng vi khuẩn và nấm men được nuôi tĩnh trên môi trường hiếu khí tổng số để tạo màng sinh học. Sau 48h, dịch nuôi cấy được hút nhẹ nhàng ra khỏi bình nuôi cấy, tránh làm vỡ màng. Rửa màng bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó, bổ sung môi trường muối khoáng nghèo dinh dưỡng và 2% dầu diesel. Sau 5 ngày nuôi tĩnh, dịch nuôi cấy được phân tích để xác định hàm lượng dầu còn lại bằng cách lấy toàn bộ dịch nuôi cấy ra, tách chiết bằng dung môi hữu cơ: aceton (1:3), ethyl acetate (chiết 3 lần). Dịch tách chiết được đem đi phân tích hóa học trên các máy sắc kí như sắc kí khí (GC), sắc kí khí khối phổ (GCMS) hoặc phân tích dầu tổng số nhằm đánh giá khả năng phân hủy và chuyển hóa các thành phần hydrocarbon của màng đa chủng thu được. Phân tích khả năng phân hủy dầu diesel được thực hiện với sự phối hợp của Viện Hóa công nghiệp, Bộ Công thương.
Qui trình chuẩn bị mẫu để phân tích các thành phần có trong dầu FO trên cơ sở phương pháp US EPA method 610:
Lấy 60ml CH2Cl2 cho vào 500ml nước thải đựng trong phễu chiết, lắc đều, để lắng chờ hỗn hợp tách thành hai pha. Tách pha CH2Cl2 (bên dưới) ra.
Tiếp tục thêm 60ml CH2Cl2 vào pha nước, làm tương tự như trên (chiết 3 lần). Gom toàn bộ dịch chiết CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4, lọc, cô quay dung môi dưới áp suất giảm đến khi còn 10ml.
Cho dịch chiết này qua cột chiết pha rắn florisil, rửa giải bằng 3ml n-hexan Hút 1ml dịch n-hexan đi phân tích GC/MS. Bơm 0.2µl mẫu vào máy GCMS Máy hệ GCMS Agilent 6980-5973N. Cột sử dụng phân tích là HP-5MS. Chương trình nhiệt độ 50 - (3 phút) - 80- (8 phút) - 200 (15 phút) - 250 (7 phút).
41
3.2.4.3. Thuyết minh chi tiết quy trình
Bước 1:
Lựa chọn các chủng vi khuẩn và nấm men sạch có khả năng tạo màng và chất hoạt động bề mặt tốt, ổn định (theo mục V.I, V.II).
Sinh khối vi khuẩn được nhân lên trong 50ml môi trường LB dịch và sinh khối nấm men được nhân lên trong 50ml môi trường Hansen dịch trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở 22-30oC trong 24 giờ.
Bước 2:
Sau 24 giờ, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút/4oC (vi khuẩn) hoặc 6000 vòng/phút/4oC (nấm men) trong 10 phút để thu sinh khối. Rửa bằng nước cất 2 lần.
Bước 3:
Hòa tan sinh khối bằng nước cất, đo OD600 và tính toán sao cho OD600 = 0,3. Bổ sung 4,5 lít môi trường LB dịch (đối với vi khuẩn) và 4,5 lít môi trường Hansen dịch (đối với nấm men) vào bình thủy tinh kích thước: 16 x 20 x 3,14 (cm2).
Bước 4:
Để tĩnh trong 24 - 72 giờ sao cho trên bề mặt bình thủy tinh xuất hiện lớp màng vi sinh vật.
Bước 5:
Dùng pipet thủy tinh hút nhẹ dịch ở dưới màng và rửa sạch màng bằng nước cất 2 lần.
Bước 6:
Bổ sung 5 lít môi trường Gost + vitamin. Tùy vào mục đích xử lý các thành phần dầu mỏ (DO, FO, hydrocarbon thơm,…) mà bổ sung các cơ chất này theo tỉ lệ thích hợp. Cụ thể: Dầu FO: 0,1-1%; Dầu DO: 1-2%; hydrocarbon thơm: 150ppm.
Bước 7:
Nuôi tĩnh sau 5, 7, 14 ngày rút mẫu ra và chiết với (1:3), ethyl acetate (chiết 3 lần) rồi mang mẫu đi phân tích sắc ký để đánh giá hiệu quả xử lý các thành phần trên.
Một số hình ảnh minh họa trong quá trình thực hiện quy trình tạo màng
(a) (b)
42
Hình 3.18. Cấu trúc hiển vi của biofilm tạo bởi các chủng vi khuẩn và cấu trúc những kênh dẫn nước cho phép dòng nước chảy qua
Hình 3.19. Ảnh hiển vi quét cho thấy cấu trúc không đồng đều bên trong biofilm tạo thành bởi các chủng nấm men
43
CHƯƠNG IV. Nội dung 4: Nghiên cứu hiệu quả xử lý các thành phần hydrocarbon no của biofilm đa chủng ở quy mô phòng thí nghiệm
4.1. Khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon no của MSH do các chủng VK tạo ra chủng VK tạo ra
4.1.1. Khả năng phân hủy dầu DO của các chủng VK tạo MSH
Dầu DO được sử dụng trong thí nghiệm có thành phần hydrocarbon chủ yếu là các hydrocarbon no, có cấu tạo từ 9 đến 20 nguyên tố carbon, được viết tắt là từ C9 đến C20. Để đánh giá khả năng phân hủy dầu DO của các chủng có khả năng tạo biofilm, chúng tôi tiến hành nuôi tĩnh các chủng này trong môi trường LB (50ml) để tạo màng. Sau 48h, dịch nuôi cấy được hút nhẹ nhàng ra khỏi bình nuôi cấy, tránh làm vỡ màng. Rửa màng bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó, bổ sung môi trường muối khoáng nghèo dinh dưỡng và 2% dầu DO. Đem nuôi tĩnh 30oC, sau 5 ngày được kết quả được trình bày trong hình 4.1:
Hình 4.1. Kết quả phân hủy dầu DO của 4 chủng sau 5 ngày nuôi tĩnh
Bằng cảm quan ta nhận thấy màu sắc của môi trường nuôi cấy đã thay đổi so với mẫu đối chứng không có vi sinh vật (mẫu K) và biofilm đã hình thành một lớp váng trên bề mặt ở mỗi mẫu. Do vậy có thể phần nào khẳng định được các chủng nghiên cứu đều có khả năng phân hủy dầu. Chúng tôi tiến hành gửi các mẫu đi phân tích ở Viện Hóa công nghiệp để có thể đánh giá chính xác khả năng phân hủy dầu DO của biofilm các chủng vi khuẩn. Bằng phương pháp phân tích khối lượng. Kết quả phân tích dầu DO của các chủng được trình bảng 4.1 sau:
K B2 B8
44
Bảng 4.1. Đánh giá khả năng phân hủy dầu DO của các chủng vi khuẩn lựa chọn bằng phương pháp phân tích khối lượng
Mẫu Hàm lượng dầu DO còn lại (mg/l) Khả năng phân hủy (%)
K 3210
B2 898,8 72
B8 963 70
B15 1884 41,13
B16 693,36 78,4
Kết quả cho thấy, các chủng B2, B8 và B16 đều có khả năng phân hủy dầu DO rất tốt. Từ kết quả này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng mô hình màng đa chủng quy mô 5 lít để đánh giá khả năng phân hủy các thành phần dầu DO của màng đa chủng. Kết quả được trình bày ở phần sau:
4.1.2. Đánh giá khả năng phân hủy dầu DO của MSH đa chủng VK bằng phương pháp GC
Dịch nuôi tĩnh sau 5 ngày với dầu DO được tách chiết và phân tích hóa học bằng phương pháp GC, kết quả thu được thể hiện trên hình 4.2 và 4.3. Sử dụng biphenyl làm chất chuẩn, chúng tôi đã bổ sung 5µl biphenyl vào tất cả các mẫu dùng để chạy sắc ký. Bằng chương trình phân tích của máy, chúng tôi đã tính toán được lượng n- alkane còn lại trong các mẫu thí nghiệm. Kết quả cho thấy, sau 5 ngày, các thành phần
n-alkane từ C9 đến C20 đã giảm từ 50 đến 87%. Trong bình thí nghiệm đối chứng, các thành phần này giảm từ 3 đến 23%. Như vậy, màng sinh học tạo thành từ hỗn hợp đa chủng có hiệu quả phân hủy các thành phần dầu DO rất rõ ràng. Đồng thời, kết quả phân tích hàm lượng dầu DO tổng số của Viện Hóa công nghiệp cũng cho thấy, sau 5 ngày 86,32% dầu đã được phân hủy.
Hình 4.2. Khả năng phân hủy các thành phần n-alkane sau 5 ngày nuôi tĩnh của biofilm đa chủng
45
Hình 4.3. Sắc ký đồ khả năng phân hủy dầu DO của biofilm do hỗn hợp các chủng vi khuẩn tạo thành sau 5 ngày nuôi tĩnh: (a), biofilm đa chủng; (b), đối chứng. Biphenyl được sử dụng làm chất chuẩn
4.2. Khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon no của MSH do các chủng NM tạo ra chủng NM tạo ra
4.2.1. Khả năng phân hủy dầu DO của các chủng NM tạo MSH
Sử dụng các điều kiện tối ưu cho các chủng TH1 và TH4 sinh trưởng và tạo màng sinh học, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng phân hủy dầu diesel của các chủng này ở các điều kiện tạo màng và tế bào tự do với nồng độ thử nghiệm là 2%. Sau 7 ngày nuôi cấy, ở điều kiện màng sinh học, chủng TH1 và TH4 tương ứng đã phân hủy 83 và 63%, còn ở điều kiện tế bào tự do thì cả hai chủng đều phân hủy được 70%. Kết quả này cho thấy chủng TH1 có khả năng phân hủy dầu DO khá tốt khi ở dạng tạo màng sinh học. Điều này được lý giải là do chủng TH1 có thể có cấu tạo đặc biệt ở màng tế bào và khả năng sinh trưởng trên môi trường bán lỏng. Vì vậy, biofilm do chủng này tạo ra còn có thể giúp cho quá trình phân huỷ dầu mỏ diễn ra nhanh và hiệu quả hơn. Còn chủng TH4 thì ở điều kiện nuôi lắc thì khả năng phân hủy nhanh hơn ở dạng tạo màng nuôi tĩnh. Song khả năng tạo màng của chủng TH4 lại tốt hơn chủng TH1, nên có thể kết hợp 2 chủng này cũng như một số chủng tạo màng tốt khác để đánh giá sự phân hủy dầu diesel của màng sinh học đa chủng.
(a)
46
4.2.2. Đánh giá khả năng phân hủy dầu DO của MSH đa chủng NM bằng phương pháp GC
Tiến hành thử nghiệm khả năng phân hủy DO của màng sinh học tạo thành từ hỗn hợp hai chủng TH1 và TH4, với nồng độ thử nghiệm là 2%. Sau 7 ngày thử nghiệm, dịch nuôi được mang đi phân tích bằng phương pháp sắc ký khí, kết quả được trình bày trên hình 4.4 và 4.5.
Hình 4.4. Khả năng phân hủy các thành phần n-alkane sau 5 ngày nuôi tĩnh của biofilm đa chủng
Đồng thời, kết quả phân tích hàm lượng dầu DO tổng số của Viện Hóa công nghiệp cũng cho thấy, sau 5 ngày 86,26% dầu đã được phân hủy.
Hình 4.5. Sắc ký đồ khả năng phân hủy DO của màng sinh học tạo thành từ các chủng nấm men TH1 và TH4: (a), đối chứng; (b), thí nghiệm. Biphenyl được sử dụng làm chất chuẩn.
(a)
(b)
Biphenyl
47
Dựa trên kết quả phân tích sắc ký khí, so sánh với chất đối chứng chuẩn là biphenyl chúng tôi nhận thấy, hầu hết các thành phần n-alkane từ C8 đến C20 đã được phân hủy hoàn toàn sau 7 ngày nuôi tĩnh.
Qua các kết quả nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy, màng sinh học tạo thành từ các chủng nấm men biển TH1 và TH4 có khả năng ứng dụng khá cao trong xử lý dầu diesel. Do vậy, các chủng này sẽ được sử dụng dể tạo màng sinh học nhằm xử lý nước ô nhiễm dầu.
KẾT LUẬN
1. Sử dụng các điều kiện tối ưu cho các chủng vi khuẩn B2, B8, B15 và B16 sinh trưởng và tạo màng sinh học, sau 5 ngày nuôi tĩnh, hàm lượng dầu DO đã được các chủng phân hủy tương ứng là: 72, 70, 41,13 và 78,4%.
Sau 5 ngày, trong mô hình màng sinh học đa chủng với nồng độ thử nghiệm là 2%, các thành phần n-alkane từ C9 đến C20 đã giảm từ 50 đến 87%. Đồng thời, hàm lượng dầu tổng số đã được phân hủy là 86,32%.
2. Sử dụng các điều kiện tối ưu cho các chủng nấm men TH1 và TH4 sinh trưởng và tạo màng sinh học, sau 7 ngày nuôi cấy, ở điều kiện màng sinh học, chủng TH1 và TH4 đã phân hủy tương ứng 83 và 63%, còn ở điều kiện tế bào tự do thì cả hai chủng đều phân hủy được 70%.
Sau 7 ngày nuôi tĩnh với nồng độ DO thử nghiệm là 2%, các thành phần n- alkane từ C8 đến C20 đã phân hủy được 50 – 100%. Đồng thời, hàm lượng dầu tổng số đã được phân hủy là 86,26%.
48
CHƯƠNG V. Nội dung 5: Nghiên cứu hiệu quả xử lý các thành phần hydrocarbon thơm của biofilm đa chủng ở quy mô phòng thí nghiệm
5.1. Khả năng phân hủy phenol của MSH do các chủng vi khuẩn tạo ra 5.1.1. Khả năng phân hủy phenol của các chủng vi khuẩn tạo MSH 5.1.1. Khả năng phân hủy phenol của các chủng vi khuẩn tạo MSH
Để đánh giá khả năng phân hủy phenol của các chủng có khả năng tạo biofilm, chúng tôi tiến hành nuôi lắc các chủng này trong môi trường muối khoáng Gost (50ml) có bổ sung 50, 100, 150 và 200ppm phenol. Sau 1, 3, 5 và 7 ngày nuôi cấy, 1ml dịch được hút ra để tiến hành đo OD. Sau 7 ngày thí nghiệm, với nồng độ 50ppm, các chủng đều có khả năng phát triển tốt; còn với nồng độ 100 và 150ppm thì các chủng B2, B8 và B16 đều có khả năng sinh trưởng cao, hình 5.1:
Hình 5.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn với hàm lượng phenol sử dụng là 100ppm (a) và 150ppm (b)
Còn ở nồng độ 200ppm phenol, chủng B8 và B16 có khả năng sinh trưởng tốt ở