DNA ựược chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle và Doyle, 1990), ựược cải tiến bởi bộ môn Sinh học phân tử và CNSH ứng dụng, Khoa
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
Công nghệ sinh học, Trường ựại học Nông nghiệp Hà Nội.
Hóa chất và ựệm:
+ DEB (DNA Extraction Buffer): 4 % CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2% β - Mercaptoethanol. Hòa tan CTAB và các hóa chất khác trong nước cất 2 lần bằng cách ủ trong waterbath ở 65oC. Thêm 2 % β -Mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng.
+ TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0.
+ Hóa chất khác: Phenol : Chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), 100 % ethanol, 76 % ethanol.
Qui trình chiết xuất DNA:
+ Thu các lá non vào buổi sáng, ựặt trên ựá lạnh và ựưa về phòng thắ nghiệm càng sớm càng tốt.
+ Cắt khoảng 100 mg mô lá vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 400 ộl DEB, tiếp tục thêm 400 ộl DEB và trộn ựều trước khi chuyển hỗn hợp vào tuble 1,5 ml. đưa ngay các tube vào ủ ở 65oC trước khi chuyển sang nghiền mẫu khác.
+ Ủ mẫu ở 65ỨC trong 1 giờ hoặc hơn. Ủ lâu hơn kết quả năng suất DNA pellet cao hơn, sạch hơn, trắng hơn (Aldrich và Cullis, 1993).
+ Chiết xuất với cùng thể tắch 25:24:1 (1:1) và trộn nhẹ nhàng bằng cách ựảo ngược các ống trong 5 phút, sau ựó ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng, 12000 rpm ựể phân tách các pha, chuyển pha lỏng phắa trên sang một tube 1,5 ml mới. Từ bước này tránh vortex, hút ựi hút lại ựặc biệt qua các ựầu pipet thể tắch nhỏ, và bất cứ thao tác nào gây ra lực cơ học ựể tránh gây ựứt gẫy DNA (Herzer, 2001).
+ Chiết với cùng thể tắch 24:1, trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp rồi lật ngửa (inverting) tubes trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng, 12000 rpm, chuyển pha lỏng phắa trên sang 1 tube mới.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
việc khoảng 70%, nếu không thấy xuất hiện tủa trắng thì ựặt mẫu ở - 20oC trong khoảng 20Ỗ ựến 2 tiếng hoặc qua ựêm nếu thấy cần thiết (Herzer, 2001).
+ Ly tâm thu tủa DNA ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút, tốc ựộ 12000 rpm. + đổ bỏ cồn, rửa pellet hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB. CTAB ựã ựược hòa tan trong ethanol, số còn lại ựược loại bỏ trong bước này (Aldrich và Cullis, 1993). Làm khô pellet trong không khắ khoảng 1h và hòa tan trong 50 ộl TE.
+ Kiểm tra chất lượng và nồng ựộ DNA bằng ựiện di trên gel agarose 1% ở hiệu ựiện thế 100V trong khoảng 15 phút. độ gọn và sáng của băng DNA cho biết mức ựộ ựứt gãy và nồng ựộ DNA tổng số.