Chương 2 đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.3. Phương pháp làm phản ứng HA
2.5.3.1. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý virus Newcastle có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, bò, người do trên bề mặt capsid có kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu và làm virus có khả năng bám vào các thụ thể của hồng cầu, làm hồng cầu ngưng kết lại nằm rải rác giống hình chiếc dù lộn ngược dưới ựáy ống nghiệm.
2.5.3.2. Cách tiến hành Chuẩn bị:
Hồng cầu gà 1%: Lấy 10ml máu gà + 5ml citratnatri 5% chống ựông, ly tâm bỏ bạch cầu và huyết tương, cho nước sinh lý vào rửa hồng cầu và ly tâm tiếp, loại bỏ phần nước trong. Làm như vậy 3 lần, lấy hồng cầu ựặc pha với nước sinh lý thành nồng ựộ 1%.
Nước trứng nghi có virus: lấy bệnh phẩm, sử lý, tiêm qua trứng, khi phôi chết, mổ trứng thu nước ựể phát hiện virus.
Tiến hành phản ứng:
- Thực hiện trên tấm nhựa vi ngưng kết có 96 giếng. - Cho vào dãy phản ứng theo sơ ựồ (bảng dưới):
Giếng Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 đC (+) đC (-) Nước sinh lý (ộl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Nước trứng (ộl) 50 50 Hiệu giá VR 1/2 Ử 1/8 1/ 16 1/ 32 1/ 64 1/ 128 1/ 256 1/ 512 1/ 1024 HC gà 1% (ộl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
Dùng micropipettes nhỏ vào tất cả các giếng mỗi giếng 50ộl nước sinh lý trừ ựối chứng (+). Sau ựó, cho vào giếng thứ nhất 50ộl kháng nguyên Newcastle. Trộn ựều rồi hút sang giếng thứ 2 50ộl, tiếp tục làm tương tự như vậy cho ựến giếng thứ 10 thì hút bỏ ựi 50ộl. Lúc này hiệu giá kháng nguyên pha loãng từ giếng 1 ựến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; Ầ ựến 1/512; 1/1024. đối chứng (-) không cho kháng nguyên Newcastle, ựối chứng (+) cho 50ộl kháng nguyên Newcastle. Tiếp ựó, cho vào tất cả các giếng 50ộl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ, ựể yên trong 20 phút ở nhiệt ựộ phòng rồi ựọc kết quả.
2.5.3.3. đọc kết quả
Phản ứng dương tắnh: Hồng cầu kết dắnh với nhau và bám vào ựáy giếng giống như chiếc dù lộn ngược như giếng ựối chứng dương.
Phản ứng âm tắnh: Hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn nhỏ, giống ựối chứng âm.
Hiệu giá ngưng kết: Là ựộ pha loãng virus lớn nhất mà ở ựó vẫn có hiện tượng ngưng kết hồng cầu rõ, người ta gọi ựó là 1 ựơn vị HA.
Hiệu giá ngưng kết càng lớn, nồng ựộ virus trong hỗn dịch càng cao. Trong phản ứng HI phải sử dụng kháng nguyên là virus Newcastle pha ở 4 ựơn vị HA, ựể phản ứng chắnh xác hơn cần phải xác ựịnh 4 ựơn vị HA.
Xác ựịnh 4 ựơn vị HA:
Trên tấm nhựa microtest plate dung 4 dãy, 4 giếng.Nhỏ vào mỗi giếng 50ộl nước sinh lý. Nhỏ vào giếng 1 của 4 dãy: 50ộl kháng nguyên ựã pha ở 4 ựơn vị
HA, trộn ựều, hút 50ộl từ giếng 1 sang giếng 2 và làm tương tự cho tới giếng thứ 3 hút bỏ ựi 50ộl. Hiệu giá HA của các giếng là: giếng 1 có 2 ựơn vị HA, giếng 2 có 1 ựơn vị HA. Giếng 3 có 0,5 ựơn vị HA. Sau ựó nhỏ hồng cầu 1% vào tất cả các giếng, giếng thứ 4 làm ựối chứng chỉ có nước sinh lý và hồng cầu.
Lắc nhẹ tấm nhựa, ựể yên 20 phút rồi ựọc kết quả. Nếu hiện tượng ngưng kết hồng cầu chỉ xảy ra ựến giếng thứ 2 khì kháng nguyên pha ựúng ở 4 ựơn vị HA.