3.2.4.1. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào nấm men
Để biết đƣợc mật độ nấm men cho vào môi trƣờng lên men vần đếm số lƣợng tế bào có trong 1ml. Vì kích thƣớc tế bào nấm men tƣơng đối lớn nên ta có thể đếm tực tiếp tế bảo trên kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu.
Tiến hành
Đặt lam kính lên khu vực buồng đếm. Lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet để lấy một giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút.
Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Đếm 5 ô vuông lớn đại diện
Cách tính: Số lƣợng tế bào có trong 1 ml mẫu nghiên cứu đƣợc tính bằng công thức:
37 Trong đó: N : số lƣợng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu
a : số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ) b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn
400 : tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm 0,1 : thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm 103 : số chuyển mm3 thành ml
10n : độ pha loãng mẫu
3.2.4.2. Định lƣợng sinh khối bằng phƣơng pháp đo mật độ quang
Định lƣợng mật độ tế bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bƣớc sóng từ 550 - 620nm.
Đối với nấm men S.cerevisiae tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 600 nm với độ pha loãng thích hợp sao cho OD < 0.7
Dựa vào đƣờng chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa độ đục và mật độ tế bào ta có thể suy ra số lƣợng tế bào có trong mẫu.
3.2.4.3. Phƣơng pháp định lƣợng đƣờng tổng
Sự định phân này dựa trên phản ứng màu đặc trƣng cho bởi đƣờng và các chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4.
Xây đựng đƣờng chuẩn đƣờng tổng:
- Pha dung dịch saccharose 0.1% (cân 500 mg đƣờng saccharose đã sấy ở 60oC và làm nguội hòa tan với 500 ml nƣớc cất)
- Pha phenol 5%: cân 5g phenol trong 100ml nƣớc cất.
- Pha dung dịch đƣờng chuẩn: dùng bình định mức 100 ml pha 5 mẫu với hàm lƣợng đƣờng saccharose 0.1% lần lƣợt theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5 ml sau đó định mức đến 100 ml. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml dịch cho vào ống nghiệm, lấy 1 ml dung dịch phenol 5% và 5 ml H2SO4 cho tiếp vào ống nghiệm, thực hiện phản ứng trong 10 phút, lắc rồi đem đun cách thủy trong 10 – 20 phút ở 25 – 30oC. Phải làm một ống thử không với 1 ml nƣớc cất thế dung dịch đƣờng.
- Khi màu bền trong vài giờ tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 490 nm. Dựng đƣờng chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa hàm lƣợng đƣờng và OD [26].
38 3.2.4.4. Xác định độ acid toàn phần
Độ acid toàn phần bao gồm tất cả các aicd hữu cơ chủ yếu là acid acetic, acid malic, acid citric, acid lactic…có thể định lƣợng đƣợc bằng dung dịch kiềm chuẩn. Chỉ thị sử dụng ở đây là phenolphthalein.
Tiến hành hút 5 ml dịch mẫu sau khi kết thúc lên men cùng với 20 ml nƣớc cất, vài giọt chỉ thị phenolphthalein vào bình tam giác 100 ml. Định phân dung dịch trên bằng dung dịch NaOH 0.1N. Phản ứng kết thúc khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Độ acid toàn phần tính theo acid citric nhƣ sau:
Trong đó: K = 0.0064 g/ml – lƣợng acid citric ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N V – thể tích dung dịch NaOH 0.1N đã chuẩn độ (ml)
Vm – thể tích dung dịch mẫu cần định lƣợng (ml) 3.2.4.5. Xác định độ cồn
Độ cồn là số ml rƣợu etylic nguyên chất trong 100 ml rƣợu thử ở nhiệt độ 20o
C. Xác định độ cồn bằng phƣơng pháp dùng bình tỷ trọng picromet tƣơng đối đơn giản, nhanh chóng và khá chính xác.
Tiến hành: lắp hệ thống chƣng cất cồn, lấy 30 ml dung dịch cần đo hàm lƣợng bioethanol, cho thêm khoảng 30 ml nƣớc cất rồi cho vào bình cầu tiến hành chƣng cất. Quá trình chƣng cất kết thúc khi thể tích dịch thu đƣợc đạt gần 30 ml, sau đó đem định mức nhanh đến 30 ml thì tiến hành đo tỷ trọng. Luôn duy trì nhiệt độ của dịch cồn chƣng đƣợc từ lúc bắt đầu đến kết thúc ≤ 20oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bình tỉ trọng đem rửa sạch, tráng kỹ bằng cồn 96oC và sấy khô đến khối lƣợng không đổi, đem cân đƣợc m (g).
- Mẫu đối chứng: cho 25 ml nƣớc cất đã làm lạnh đến 20oC vào bình tỉ trọng và cân, đƣợc m2 (g).
- Mẫu kiểm tra: thay nƣớc cất trong bình trên bằng 25 ml bioethanol (20oC) chƣng cất đƣợc đem cân đƣợc m1 (g).
39 Tỷ trọng của bioethanol ở 20oC đƣợc tính theo công thức sau:
Dựa vào bảng tra nồng độ bioethanol nguyên chất theo tỉ trọng ở 20oC, suy ra hàm lƣợng bioethanol trong sản phẩm chƣng cất cũng nhƣ trong dịch ban đầu.
40
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN