3.2.1. Kiểm tra giống
3.2.1.1. Khảo sát đặc tính sinh học của nấm men
Giống nấm men trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng lên men cần đƣợc kiểm tra xem có nhiễm các vi sinh vật khác hay không. Kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm tế bào: sử dụng thuốc nhuộm fuchsin.
Tiến hành: bằng thao tác vô trùng sử dụng que cấy lấy một giọt dịch huyền phù tế bào cho vào lam kính, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu. Nhỏ một giọt fuchsin vào sau đó rửa lại bằng nƣớc, để khô tự nhiên. Nhỏ một giọt dầu soi kính và quan sát tế bào dƣới kính hiển vi.
Quan sát tỷ lệ sống chết của tế bào sử dụng thuốc nhuộm methylen blue. Tiến hành lấy một ít huyền phù tế bào trong môi trƣờng nhân giống cho vào lam kính, nhỏ trực tiếp methylen blue vào, đặt lam kính lên tránh tạo bọt khí và quan sát chúng dƣới kính hiển vi.
3.2.1.2. Dựng đƣờng cong sinh trƣởng và đƣờng chuẩn của nấm men
Nhân giống nấm men trong môi trƣờng Hansen, tiến hành lấy mẫu theo từng khoảng thời gian, pha loãng đo OD ở bƣớc sóng 600 nm. Đồng thời lấy mẫu vửa đo OD đem đếm trực tiếp số lƣợng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu. Ứng với giá trị OD đo đƣợc và số tế bào đếm đƣợc ta xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn của nấm men.
35 Tƣơng tự ta tiến hành dựng đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men thể hiên mối quan hệ giữa thời gian nuôi cấy và độ đục của môi trƣờng, sau đó dựa vào đƣờng chuẩn xác định số lƣợng tế bào có trong môi trƣờng vào từng thời điểm.
3.2.2. Khảo sát khả năng lên men đƣờng glucose của nấm men S.cerevisiae
3.2.2.1. Khảo sát tỷ lệ giống
Thực hiện lên men 3 mẫu dịch đƣờng (50 ml, nồng độ đƣờng 15% (w/v)) với các tỷ lệ giống nấm men khác nhau: 5%, 7% và 10% (v/v). Lên men trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng.
Sau khi lên men xong lấy khoảng 30 ml dịch lên men tiến hành chƣng cất để xác định hàm lƣợng ethanol tạo thành.
3.2.2.2. Khảo sát thời gian lên men
Sau khi khảo sát tỷ lệ giống thích hợp cho độ cồn cao nhất. Sử dụng tỷ lệ giống đó để khảo sát thời gian lên men thích hợp. Sử dụng đƣờng có nồng độ 15% (w/v) lên men trong thời gian 1, 2, 3 ngày.
3.2.2.3. Khảo sát các nồng độ đƣờng khác nhau cho lên men
Thực hiện lên men các mẫu dịch đƣờng có nồng độ nhƣ sau: 70 g/l, 80 g/l và 150 g/l trong vòng 3 ngày với tỷ lệ giống 7% (v/v)
Sau khi lên men kết thúc lấy 30 ml dịch sau lên men đem chƣng cất thu nhận cồn để xác định hàm lƣợng ethanol tạo thành
3.2.3. Tiền xử lý lõi bắp và lên men
Lõi bắp đƣợc tiền xử lý bằng phƣơng pháp sinh học. Thành phần môi trƣờng lên men bán rắn:
MgSO4.7H2O – 1.6 g/l ZnSO4 – 0.007 g/l KH2PO4 – 2 g/l Glucose – 8 g/l FeSO4.7H2O – 0.004 g/l (NH4)2SO4 – 0.12 g/l NaCl – 0.4 g/l MnSO4.H2O – 0.28 g/l
Vi sinh vật sử dụng là nấm mốc Phanerochaete chrysosporium. Nấm này đƣợc nuôi trong môi trƣờng PGA trong vòng 5 đến 7 ngày. Độ ẩm môi trƣờng lên men bán rắn là 70%, lõi bắp ban đầu có độ ẩm 13%.
36 Tiến hành: sử dụng 15g lõi bắp cho vào erlen 250 ml, sau đó cho tiếp 25 ml môi trƣờng lên men vào tiến hành xử lý với thời gian lần lƣợt từ 14, 18, 21 ngày.
Sau thời gian xử lý, phần bã rắn đƣợc rửa sạch bằng nƣớc và đem sấy khô sau đó tiến hành đƣờng hóa sử dụng 10% enzyme thƣơng mại, đƣờng hóa ở 50oC trong 20 ml đệm citrate ở pH 4.8. Tỷ lệ nguyên liệu là 5%.
Đƣờng hóa trong 48 giờ, sau đó lọc lấy dịch đem hấp tiệt trùng ở 121oC, 15 phút để tiến hành lên men. Cho 7% (v/v) giống nấm men vào dịch lõi bắp lên men trong 3 ngày, sau khi kết thúc quá trình lên men lấy khoảng 30 ml dịch lên men đem đi chƣng cất để xác định hàm lƣợng ethanol.
3.2.4. Các phƣơng pháp kiểm tra
3.2.4.1. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào nấm men
Để biết đƣợc mật độ nấm men cho vào môi trƣờng lên men vần đếm số lƣợng tế bào có trong 1ml. Vì kích thƣớc tế bào nấm men tƣơng đối lớn nên ta có thể đếm tực tiếp tế bảo trên kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu.
Tiến hành
Đặt lam kính lên khu vực buồng đếm. Lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet để lấy một giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên vài phút.
Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Đếm 5 ô vuông lớn đại diện
Cách tính: Số lƣợng tế bào có trong 1 ml mẫu nghiên cứu đƣợc tính bằng công thức:
37 Trong đó: N : số lƣợng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu
a : số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ) b : số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn
400 : tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm 0,1 : thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm 103 : số chuyển mm3 thành ml
10n : độ pha loãng mẫu
3.2.4.2. Định lƣợng sinh khối bằng phƣơng pháp đo mật độ quang
Định lƣợng mật độ tế bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bƣớc sóng từ 550 - 620nm.
Đối với nấm men S.cerevisiae tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 600 nm với độ pha loãng thích hợp sao cho OD < 0.7
Dựa vào đƣờng chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa độ đục và mật độ tế bào ta có thể suy ra số lƣợng tế bào có trong mẫu.
3.2.4.3. Phƣơng pháp định lƣợng đƣờng tổng
Sự định phân này dựa trên phản ứng màu đặc trƣng cho bởi đƣờng và các chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4.
Xây đựng đƣờng chuẩn đƣờng tổng:
- Pha dung dịch saccharose 0.1% (cân 500 mg đƣờng saccharose đã sấy ở 60oC và làm nguội hòa tan với 500 ml nƣớc cất)
- Pha phenol 5%: cân 5g phenol trong 100ml nƣớc cất.
- Pha dung dịch đƣờng chuẩn: dùng bình định mức 100 ml pha 5 mẫu với hàm lƣợng đƣờng saccharose 0.1% lần lƣợt theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5 ml sau đó định mức đến 100 ml. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml dịch cho vào ống nghiệm, lấy 1 ml dung dịch phenol 5% và 5 ml H2SO4 cho tiếp vào ống nghiệm, thực hiện phản ứng trong 10 phút, lắc rồi đem đun cách thủy trong 10 – 20 phút ở 25 – 30oC. Phải làm một ống thử không với 1 ml nƣớc cất thế dung dịch đƣờng.
- Khi màu bền trong vài giờ tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 490 nm. Dựng đƣờng chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa hàm lƣợng đƣờng và OD [26].
38 3.2.4.4. Xác định độ acid toàn phần
Độ acid toàn phần bao gồm tất cả các aicd hữu cơ chủ yếu là acid acetic, acid malic, acid citric, acid lactic…có thể định lƣợng đƣợc bằng dung dịch kiềm chuẩn. Chỉ thị sử dụng ở đây là phenolphthalein.
Tiến hành hút 5 ml dịch mẫu sau khi kết thúc lên men cùng với 20 ml nƣớc cất, vài giọt chỉ thị phenolphthalein vào bình tam giác 100 ml. Định phân dung dịch trên bằng dung dịch NaOH 0.1N. Phản ứng kết thúc khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Độ acid toàn phần tính theo acid citric nhƣ sau:
Trong đó: K = 0.0064 g/ml – lƣợng acid citric ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N V – thể tích dung dịch NaOH 0.1N đã chuẩn độ (ml)
Vm – thể tích dung dịch mẫu cần định lƣợng (ml) 3.2.4.5. Xác định độ cồn
Độ cồn là số ml rƣợu etylic nguyên chất trong 100 ml rƣợu thử ở nhiệt độ 20o
C. Xác định độ cồn bằng phƣơng pháp dùng bình tỷ trọng picromet tƣơng đối đơn giản, nhanh chóng và khá chính xác.
Tiến hành: lắp hệ thống chƣng cất cồn, lấy 30 ml dung dịch cần đo hàm lƣợng bioethanol, cho thêm khoảng 30 ml nƣớc cất rồi cho vào bình cầu tiến hành chƣng cất. Quá trình chƣng cất kết thúc khi thể tích dịch thu đƣợc đạt gần 30 ml, sau đó đem định mức nhanh đến 30 ml thì tiến hành đo tỷ trọng. Luôn duy trì nhiệt độ của dịch cồn chƣng đƣợc từ lúc bắt đầu đến kết thúc ≤ 20oC.
- Bình tỉ trọng đem rửa sạch, tráng kỹ bằng cồn 96oC và sấy khô đến khối lƣợng không đổi, đem cân đƣợc m (g).
- Mẫu đối chứng: cho 25 ml nƣớc cất đã làm lạnh đến 20oC vào bình tỉ trọng và cân, đƣợc m2 (g).
- Mẫu kiểm tra: thay nƣớc cất trong bình trên bằng 25 ml bioethanol (20oC) chƣng cất đƣợc đem cân đƣợc m1 (g).
39 Tỷ trọng của bioethanol ở 20oC đƣợc tính theo công thức sau:
Dựa vào bảng tra nồng độ bioethanol nguyên chất theo tỉ trọng ở 20oC, suy ra hàm lƣợng bioethanol trong sản phẩm chƣng cất cũng nhƣ trong dịch ban đầu.
40
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
4.1. Phân lập, kiểm tra giống 4.1.1. Kiểm tra hình thái tế bào 4.1.1. Kiểm tra hình thái tế bào
Sau 48 h nhân giống, tiến hành nhuộm tế bào để quan sát hình thái tế bào và xem môi trƣờng nhân giống có bị nhiễm các vi sinh vật khác hay không.
Hình 4.1: Dịch nhân giống nấm men sau 48h và tế bào nấm men
Kết quả cho thấy tế bào nấm men đang phát triển, tế bào có hình cầu, kích thƣớc to đồng đều, bắt màu thuốc nhuộm tốt và quan sát rõ dƣới hính hiển vi. Có một số tế bào đang trong giai đoạn nảy chồi, không xuất hiện các hình dạng lạ chứng tỏ môi trƣờng nhân giống không bị nhiễm các vi sinh vật khác
Sử dụng môi trƣờng nhân giống trãi đĩa ta thấy các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, mọc lồi, to, phát triển đổng đều, không xuất hiện các vi sinh vật tạp nhiễm
41 Hình 4.2: Khuẩn lạc S.cerevisiae.
4.1.2. Xây dựng đƣờng chuẩn sinh khối
Để xác định đƣợc mối quan hệ giữa mật độ tế bào và giá trị OD tƣơng ứng ta tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn thể hiện mối quan hệ đó.
Bảng 4.1: Mối quan hệ giữa mật độ tế bào và OD
Mẫu Mật độ tế bào
(tế bào/ml) OD600 Log (tế bào/ml)
1 6,3.106 0,306 6,80
2 10,2.106 0,414 7,01
3 26,25.106 0,619 7,42
4 32,95.106 0,715 7,52
42 Hình 4.3: Đƣờng chuẩn biễu diễn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào
4.1.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men
Hình 4.4: Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men
Theo đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men ta có thể thấy rõ các giai đoạn phát triền của chúng. Nhƣ vậy tại thời điểm lên men từ 32h cho đến 48h nấm men đang trong giai đoạn. Vì thế ta tiến hành chọn thời gian là 48h để lấy giống cho lên men.
y = 1.5208x + 6.3875 R² = 0.9659 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Log (TB/m l) OD 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 20 40 60 80 100 120 OD
43 4.2. Khảo sát khả năng lên men đƣờng glucose
Hình 4.5: Dịch đƣờng sau lên men 4.2.1. Khảo sát tỷ lệ giống
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của % nấm men (v/v) đến quá trình lên men Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của % nấm men Tỷ lệ giống (v/v) Độ cồn (%V) Hiệu suất (%) 5% 7.16 73.7 7% 8.6 88.57 10% 7.47 76.96
44 Hình 4.6: Đồ thị biễu diễn độ cồn theo tỷ lệ giống
Kết quả cho thấy mật độ nấm men khoảng 7% (v/v) là thích hợp nhất cho quá trình lên men vì độ cồn ta thu đƣợc là cao nhất. Theo đồ thị trên, khi ta tăng tỷ lệ giống từ 5% (v/v) đến 7% (v/v) thì độ cồn tăng lên khá nhanh từ 7,16% V đến 8,6 %V, nhƣng nếu ta tiếp tục tăng tỷ lệ giống đến 10% (v/v) thì độ cồn lại giảm mạnh xuống 7,47 %V, quá trình chuyển hóa này không tuyến tính với tỷ lệ giống. Điều này cho thấy mỗi loại nấm men sẽ lên men tốt nhất ở một mật độ nhất định, cho dù ta có tiếp tục tăng lên thì hiệu quả quá trình lên men cũng không tăng nữa.
Do bản chất của quá trình lên men là các phản ứng oxi hóa khử diễn ra dƣới tác dụng của enzyme bên trong tế bào nấm men, nên khi ta tăng mật độ giống lên thì số lƣợng các phân tử đƣờng bị oxi hóa cũng tăng lên. Nhƣng khi mật độ nấm men cao chúng sẽ sử dụng đƣờng trƣớc tiên cho việc tăng sinh khối nên điều này không có lợi cho quá trình lên men và có sự cạnh tranh nguồn cơ chất trong môi trƣờng lên men.
6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 4 6 8 10 12 %V % giống (v/v)
45 4.2.2. Khảo sát thời gian lên men
Kết quả khảo sát thời gian lên men thu đƣợc nhƣ sau:
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến độ cồn Thời gian (ngày) Độ cồn (%V)
1 ngày 2.24
2 ngày 4.22
3 ngày 8.68
Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn độ cồn theo thời gian lên men
Khảo sát thời gian lên men đƣờng của nấm men trong 3 ngày, theo đồ thị ta thấy thời gian càng tăng thì độ cồn cũng tăng, sau thời gian lên men 2 ngày độ cồn chỉ tăng từ 2.24%V đến 4.43%V nhƣng sang ngày thứ 3 thì độ cồn tăng nhanh đến 8.6 %V. thời gian lên men ảnh hƣởng đến hiệu quả của quá trình lên men và khả năng lên men của nấm men nếu thời gian lên men quá ngắn nấm men không kip sử dụng hết đƣờng cho quá trình lên men vì thế lƣợng cồn tạo thành ít và lƣợng đƣờng còn sót lại trong môi trƣờng lên men nhiều làm cho hiệu quả của quá trình lên men thấp. Ngƣợc lại nếu thời gian lên men quá dài sẽ sinh ra các sản phẩm phụ làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng cồn thu đƣợc, bên cạnh đó
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 %V
46 lƣợng cồn tạo thành nhiều có thể ức chế lại hoạt động của nấm men nên dù có kéo dài thời gian lên men thì nấm men cũng không thể chuyển hóa đƣờng trong môi trƣờng để tạo đồ cồn cao hon nữa vì mỗi giống nấm men sẽ lên men cho độ cồn nhất định. Nhƣ vậy thì thời gian thích hợp nhất cho quá trình lên men trong nghiên cứu này là 3 ngày.
4.2.3. Khảo sát nồng độ đƣờng
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến quá trình lên men Nồng độ đƣờng (w/v) Độ cồn (%V) 7% 3.57 8% 4.43 15% 8.6
Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn độ cồn theo nồng độ đƣờng.
Theo đồ thị ta thấy sau ba ngày lên men khi tăng dần nồng độ đƣờng lên từ 8% (w/v) lên 15% (w/v) thì độ cồn tăng rất nhanh từ 4.43 %V đến 8.6%V, điều này là do khi hàm lƣợng đƣờng trong môi trƣờng nhiều thì nấm men có đầy đủ chất dinh dƣỡng để có thể vừa phát triển vừa chuyển hóa đƣờng thành cồn, mặc dù nồng độ đƣờng cao có thể ức chế hoạt động của nấm men nhƣng theo lý thuyết và thực nghiệm trong sản xuất rƣợu
2 3 4 5 6 7 8 9 5% 7% 9% 11% 13% 15% 17% %V Hàm lƣợng đƣờng (% w/v)
47 nồng độ đƣờng khoảng 13 - 15% (w/v) là thích hợp nhất cho nấm men tiến hành lên men vì thế ta chọn nồng độ đƣờng là 15% (w/v) để tiến hành quá trình lên men.
Trong quá trình lên men đƣờng thành cồn khi nồng độ đƣờng cao sẽ tạo áp suất thẩm thấu sẽ lớn ảnh hƣởng đến hiệu quả lên men, dẫn đến nấm men lên men không triệt để làm cho hàm lƣợng đƣờng sót tăng, đồng thời phải kéo dài thời gian lên men và gây tổn hao nguồn nguyên liệu, quá trình lên men không kinh tế. Còn khi nồng độ đƣờng thấp cũng không có lợi cho lên men vì tổn thất do tạo men tăng và không đủ dinh dƣỡng cho nấm men phát triển, độ cồn thu đƣợc thấp và ảnh hƣởng đến chất lƣợng cồn thu đƣợc.
4.3. Độ acid toàn phần 4.3.1. Theo mật độ giống 4.3.1. Theo mật độ giống
Bảng 4.5: Độ acid toàn phần theo mật độ giống