2.5.3.1. Nhiệt độ
Mỗi vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tố ƣu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm
men S.cerevisiae nhiệt độ tối ƣu của giống nằm trong khoảng 28 – 32oC. Ở nhiệt độ cao
hoạt tính nấm men giảm. Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ nhƣ ester, aldehyde gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng cồn thu đƣợc và tổn thất bioethanol theo CO2 sẽ tăng [1].
2.5.3.2. pH
Nồng độ ion H+ trong canh trƣờng ảnh hƣởng lớn đến hoạt động của nấm men, chúng có khả năng làm thay đổi diện tích vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dƣỡng cũng nhƣ chiều hƣớng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này chỉ phụ thuộc vào pH của canh trƣờng.
Trong điều kiện lên men bioethanol pH tối ƣu cho hoạt động lên men là 4.5 – 5. Nếu pH thấp nấm men còn hoạt động đƣợc và vi khuẩn bị ức chế. pH cao hơn sẽ tạo ra
27 sản phẩm có độ chua thấp, dễ bị nhiễm khuẩn và tạo ra nhiều sản phẩm phụ hơn dẫn đến hiệu suất lên men thấp [1].
2.5.3.3. Nồng độ dịch lên men
Nồng độ dịch đƣờng quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là rƣợu nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đƣờng nhiều sẽ dẫn đến tổn thất và làm tăng thời gian lên men. Nhƣng ngƣợc lại nếu nồng độ đƣờng thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men [1].
Bình thƣờng ngƣời ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đƣờng từ 16 – 18% tƣơng đƣơng 13 – 15% đƣờng, để sau khi lên men sẽ nhận đƣợc nồng độ rƣợu trong giấm chín là 8.5 – 9.5 %V [1].
2.5.3.4. Nồng độ CO2 trong môi trƣờng
CO2 là một sản phẩm của quá trình lên men rƣợu từ đƣờng, một phần CO2 sẽ tồn tại trong môi trƣờng, một phần sẽ tách lên trên bề mặt môi trƣờng, phần còn lại tích tụ thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trƣờng. Khi CO2 tích tụ lại trong môi trƣờng sẽ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men nhƣng không làm khả năng lên men của nấm men bị yếu đi.
Trong môi trƣờng lên men CO2 nằm ở khoảng giữa bề mặt môi trƣờng và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của các vi sinh vật hiếu khí có hại cho quá trình lên men [7].
2.5.3.5. Thành phần các chất dimh dƣỡng trong môi trƣờng lên men
Trong môi trƣờng lên men cần phải cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng chủ yếu cho nấm men bao gồm các glucid ở dạng monosacchride và disaccharide; nitơ ở dạng acid amin, các muối vô cơ, các vitamin và muối khoáng…[6].
2.5.3.6. Vi sinh vật tạp nhiễm
Dịch đƣờng lên men không chỉ là môi trƣờng dinh dƣỡng tốt cho nấm men mà còn cho các vi sinh vật khác. Trong nƣớc, trong không khí cũng nhƣ trong các nguyên liệu tham gia vào thành phần môi trƣờng luôn chứa một lƣợng vi sinh vật có hại cho lên men
28 rƣợu. Các vi sinh vật nếu lẫn vào dịch đƣờng chúng sẽ biến đƣờng thành các sản phẩm khác và làm giảm hiệu suất lên men rƣợu [1].
Sự xuất hiện của các vi sinh vật sinh axit nhƣ các vi khuẩn lactic, các vi khuẩn axetic và đặc biệt là các vi khuẩn butyric thƣờng có ảnh hƣởng đến sự phát triển của nấm men một cách rõ rệt.
- Vi khuẩn lactic: thƣờng là loại vi khuẩn lactic dị hình, chúng sử dụng đƣờng và tạo ra axit lactic. Ngoài ra còn tạo ra một lƣợng đáng kể các chất khác nhƣ alcol, axit axetic, cacbonic, diaxetyl và axetone. Các sản phẩm đƣợc tạo ra phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, pH, độ yếm khí…chùng làm cho sản phẩm tạo thành không ổn định [1].
- Vi khuẩn axetic: trong môi trƣờng có nồng độ alcol thấp chúng phát triển rất tốt và oxi hóa alcol thành axit axetic. Trong môi trƣờng không có alcol chúng sẽ oxi hóa đƣờng thành axit gluconic [1].
- Vi khuẩn butyric và các vi sinh vật khác: các vi khuẩn này chỉ phát triển trong dịch chƣa lên men. Nhƣng trong điều kiện lên men các vi khuẩn này không thể phát triển vì pH tối thích của chúng đều nằm trong môi trƣờng kiềm yếu hay trung tính. Nhƣ vậy nhiễm khuẩn trong điều kiện lên men rƣợu chủ yếu là vi khuẩn lactic [1]. 2.6. Tính chất hóa lý của lõi bắp
Ở Việt Nam, bắp là một loại cây lƣơng thực trồng rất phổ biến ở vùng Trung du miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ, vùng duyên hải miền Trung và Tây nguyên. Diện tích trồng bắp ở Việt Nam khá lớn khoảng 1126 nghìn ha, bên cạnh việc sử dụng hạt bắp cho nhu cầu lƣơng thực thì lõi bắp đƣợc thải ra chiếm một khối lƣợng rất lớn nhƣng chƣa đƣợc sử dụng hợp lý.
Trƣớc đây lõi bắp đã đƣợc sử dụng nhƣ một nhiên liệu đốt trực tiếp trong nấu ăn và sƣởi ấm ở quy mô nhỏ. Việc sử dụng lõi bắp làm nguyên liệu cho sản xuất năng lƣợng là một khái niệm hiện đại với quy mô lớn hơn.
29 2.6.1. Cấu tạo
Lõi bắp khá cứng bao gồm nhiều loại mô khác nhau nhìn chung có thể chia làm 4 vùng: vùng lõi, vùng mày, vùng rạ và vùng mô cứng.
Hình 2.11: Mặt cắt ngang của lõi bắp 2.6.2. Tính chất
Trong lõi bắp có chứa khoảng 32.3 – 45.6% cellulose, 39.8% hemicelluloses – chủ yếu là đƣờng pentose và 6.7 – 13.9% lignin (có thể thay đổi tùy theo giống) [31]. Hàm lƣợng cellulose trong lõi bắp tƣơng đối cao so với các phế liệu nông nghiệp khác. Hàm lƣợng hemicellulose chiếm thứ hai trong lõi ngô, tồn tại ở trạng thái vô định hình, dễ thấm nƣớc và cản trở sự tiếp xúc của enzyme với cellulose vì vậy cần phải loại bỏ trong quá trình xử lý, tuy nhiên bản thân hemicellulose là một polysaccharide nên có thể tận dụng để lên men. Phần còn lại trong lõi ngô là lignin chiếm hàm lƣợng tƣơng đối thấp và cần loại bỏ để tăng khả năng tiếp xúc của enzyme với cellulose.
30 Bảng 2.5: Các thành phần lignocellulose trong lõi bắp theo khối lƣợng khô [13]
Thành phần Khối lƣợng khô (%) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cellulose 35 – 48
Hemicellulose 22 – 30
Lignin 15 – 27
Trong lõi bắp mật độ năng lƣợng không dày đặt nhƣ trong nhiên liệu hóa thạch, mật độ năng lƣợng của chúng gần với các loại nhiên liệu biomass và ít hơn so với than đá, nhƣng lại đƣợc sử dụng trên khắp thế giới. Bảng dƣới đây so sánh mật độ năng lƣợng theo thể tích và khối lƣợng của một vài nguyên liệu [8].
Bảng 2.6: Mật độ năng lƣợng của lõi bắp so với các nhiên liệu khác [20] Loại nhiên
liệu Lõi bắp
Rơm rạ
Cây
thân cỏ Gỗ vụn Than đá Dầu nhiên liệu Năng lƣợng chứa đựng (MJ/kg) 18.25 – 19.18 17 18 19 25.5 43.5 Năng lƣợng chứa đựng (MJ/ m3) 4960 – 5210 2550 2500 12400 17200 – 23300 38600
31 2.7. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất bioethanol từ lõi bắp
Hình 2.12: Sơ đồ quy trình công nghệ
Thuyết minh quy trình: lõi bắp sau khi đã xác định đƣợc độ ẩm ban đầu sẽ cho tiến hành quá trình nghiền nhằm làm giảm kích thƣớc nguyên liệu chuẩn bị cho quá trình tiền xử lý. Lõi bắp có thể đƣợc tiền xử lý bằng phƣơng pháp vật lý, hóa học hay sinh học để tách cellulose ra khỏi thành phần với hemicellulose và lignin, đồng thời cũng để loại bỏ lignin trong nguyên liệu. Lõi bắp sau khi đƣợc tiền xử lý sẽ đƣợc rửa sạch nhằm loại bỏ vi sinh vật hay các hóa chất còn sót lại của quá trình tiền xử lý sau đó tiến hành quá trình đƣờng hóa sử dụng enzyme cellulase để chuyển hóa cellulose thành đƣờng cho nấm men
Sacchromyces cerevisiae sử dụng để tiếp tục quá trình lên men. Tiến hành lên men ở điều
32
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nấm men Saccharomyces cerevisiae đƣợc nhận từ Bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Nấm men đƣợc nuôi trên thạch nghiêng bảo quản ở 4oC. Cấy chuyền sau mỗi 4 tuần.
Chủng Phanerochaete chrysosporium từ Bộ môn Công nghệ Sinh học đƣợc trữ trên môi trƣờng thạch PGA ở 4-5oC. Cấy chuyền mỗi 4 tuần.
Lõi bắp sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc lấy từ tỉnh Đắk Lắk, với độ ẩm ban đầu khoảng 13%.
3.1.2. Hóa chất – dụng cụ - thiết bị
Hóa chất
- Các hóa chất cần thiết cho môi trƣờng nuôi cấy nấm men: glucose, pepton, K2HPO4, MgSO4.
- Cồn 90oC: sử dụng đốt đèn cồn, pha dung dịch sát trùng, tráng rửa dụng cụ.
- Dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn độ
- Thuốc thử phenolphthalein
- Các thuốc thử: methylen blue, fuchsin, dầu soi kính dùng để nhuộm tế bào và quan sát hình thái, tỷ lệ sống chết của nấm men trong môi trƣờng nhân giống.
Dụng cụ
- Ống nghiệm: 20 cái; erlen 250 ml: 10 cái; erle 100 ml: 5 cái; becher 250 ml: 1 cái; becher 500 ml: 1 cái; becher 1000 ml: 1 cái; đĩa petri.
- Đèn cồn: 2 cái. Que cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bình tỷ trọng 25 ml. Thiết bị
- Cân phân tích, kính hiển vi, máy so màu, máy lắc, tủ cấy, máy sấy, hệ thống lên men, hệ thống chƣng cất cồn.
33
3.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng sử dụng cho nuôi cấy nấm men là môi trƣờng Hansen. Thành phần môi trƣờng: Glucose 50 g/l K2HPO4 3 g/l MgSO4 3 g/l Pepton 3 g/l Agar 20 g/l Nƣớc cất đủ đến 1 lít
Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy nấm mốc là môi trƣờng PGA. Thành phần môi trƣờng:
Khoai tây 200 g/l Glucose 20 g/l
Agar 20 g/l
Cách làm môi trƣờng PGA: lấy 200g khoai tây cho vào khoảng 800 ml nƣớc cất đun sôi khoảng 30 phút, lọc lấy nƣớc cho thêm 20g glucose sau đó định mức đến 1 lít. Cho thêm vào 20g agar đun sôi cho agar tan hết sau đó đổ môi trƣờng vào các ống nghiệm, đem hấp ở 121oC trong 20 phút. Sau đó lấy ra làm thạch nghiêng chuẩn bị cho cấy giống.
Nhân giống nấm men
Giống nấm men trƣớc khi đƣa vào lên men cần đƣợc nhân giống để làm tăng sinh khối, tăng hoạt lực sống. môi trƣờng nhân giống nấm men cũng là mội trƣờng nuối cấy nấm men. Ta tiến hành nhân giống qua hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: sau khi nấm men đã phát triển trên môi trƣờng thạch nghiêng, cấy giống nấm men vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trƣờng Hansen đã đƣợc hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút. Nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Giai đoạn 2: sau 24 giờ cho toàn bộ giống trong ống nghiệm vào erlen có chứa môi
trƣờng Hansen đã đƣợc hấp tiệt trùng và nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, lắc 180 rpm trong vòng 48 giờ.
34 Nhân giống nấm mốc
Thành phần môi trƣờng nhân giống:
Cám 70%
Trấu 29%
Amoni sulfate 1%
Tiến hành: cho 10 ml nƣớc cất thanh trùng vào ống giống, dùng que cấy mài nhẹ lên mặt thạch để tách bào tử, sau đó đổ toàn bộ nƣớc có chứa bào tử vào vào 50 g môi trƣờng nhân giống và trộn kỹ. Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày rồi bảo quản ở 40oC [6].
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Kiểm tra giống 3.2.1. Kiểm tra giống
3.2.1.1. Khảo sát đặc tính sinh học của nấm men
Giống nấm men trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng lên men cần đƣợc kiểm tra xem có nhiễm các vi sinh vật khác hay không. Kiểm tra bằng phƣơng pháp nhuộm tế bào: sử dụng thuốc nhuộm fuchsin.
Tiến hành: bằng thao tác vô trùng sử dụng que cấy lấy một giọt dịch huyền phù tế bào cho vào lam kính, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu. Nhỏ một giọt fuchsin vào sau đó rửa lại bằng nƣớc, để khô tự nhiên. Nhỏ một giọt dầu soi kính và quan sát tế bào dƣới kính hiển vi.
Quan sát tỷ lệ sống chết của tế bào sử dụng thuốc nhuộm methylen blue. Tiến hành lấy một ít huyền phù tế bào trong môi trƣờng nhân giống cho vào lam kính, nhỏ trực tiếp methylen blue vào, đặt lam kính lên tránh tạo bọt khí và quan sát chúng dƣới kính hiển vi.
3.2.1.2. Dựng đƣờng cong sinh trƣởng và đƣờng chuẩn của nấm men
Nhân giống nấm men trong môi trƣờng Hansen, tiến hành lấy mẫu theo từng khoảng thời gian, pha loãng đo OD ở bƣớc sóng 600 nm. Đồng thời lấy mẫu vửa đo OD đem đếm trực tiếp số lƣợng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu. Ứng với giá trị OD đo đƣợc và số tế bào đếm đƣợc ta xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn của nấm men.
35 Tƣơng tự ta tiến hành dựng đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men thể hiên mối quan hệ giữa thời gian nuôi cấy và độ đục của môi trƣờng, sau đó dựa vào đƣờng chuẩn xác định số lƣợng tế bào có trong môi trƣờng vào từng thời điểm.
3.2.2. Khảo sát khả năng lên men đƣờng glucose của nấm men S.cerevisiae
3.2.2.1. Khảo sát tỷ lệ giống
Thực hiện lên men 3 mẫu dịch đƣờng (50 ml, nồng độ đƣờng 15% (w/v)) với các tỷ lệ giống nấm men khác nhau: 5%, 7% và 10% (v/v). Lên men trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi lên men xong lấy khoảng 30 ml dịch lên men tiến hành chƣng cất để xác định hàm lƣợng ethanol tạo thành.
3.2.2.2. Khảo sát thời gian lên men
Sau khi khảo sát tỷ lệ giống thích hợp cho độ cồn cao nhất. Sử dụng tỷ lệ giống đó để khảo sát thời gian lên men thích hợp. Sử dụng đƣờng có nồng độ 15% (w/v) lên men trong thời gian 1, 2, 3 ngày.
3.2.2.3. Khảo sát các nồng độ đƣờng khác nhau cho lên men
Thực hiện lên men các mẫu dịch đƣờng có nồng độ nhƣ sau: 70 g/l, 80 g/l và 150 g/l trong vòng 3 ngày với tỷ lệ giống 7% (v/v)
Sau khi lên men kết thúc lấy 30 ml dịch sau lên men đem chƣng cất thu nhận cồn để xác định hàm lƣợng ethanol tạo thành
3.2.3. Tiền xử lý lõi bắp và lên men
Lõi bắp đƣợc tiền xử lý bằng phƣơng pháp sinh học. Thành phần môi trƣờng lên men bán rắn:
MgSO4.7H2O – 1.6 g/l ZnSO4 – 0.007 g/l KH2PO4 – 2 g/l Glucose – 8 g/l FeSO4.7H2O – 0.004 g/l (NH4)2SO4 – 0.12 g/l NaCl – 0.4 g/l MnSO4.H2O – 0.28 g/l
Vi sinh vật sử dụng là nấm mốc Phanerochaete chrysosporium. Nấm này đƣợc nuôi trong môi trƣờng PGA trong vòng 5 đến 7 ngày. Độ ẩm môi trƣờng lên men bán rắn là 70%, lõi bắp ban đầu có độ ẩm 13%.
36 Tiến hành: sử dụng 15g lõi bắp cho vào erlen 250 ml, sau đó cho tiếp 25 ml môi trƣờng lên men vào tiến hành xử lý với thời gian lần lƣợt từ 14, 18, 21 ngày.
Sau thời gian xử lý, phần bã rắn đƣợc rửa sạch bằng nƣớc và đem sấy khô sau đó tiến hành đƣờng hóa sử dụng 10% enzyme thƣơng mại, đƣờng hóa ở 50oC trong 20 ml đệm citrate ở pH 4.8. Tỷ lệ nguyên liệu là 5%.
Đƣờng hóa trong 48 giờ, sau đó lọc lấy dịch đem hấp tiệt trùng ở 121oC, 15 phút để tiến hành lên men. Cho 7% (v/v) giống nấm men vào dịch lõi bắp lên men trong 3 ngày, sau khi kết thúc quá trình lên men lấy khoảng 30 ml dịch lên men đem đi chƣng cất để xác định hàm lƣợng ethanol.
3.2.4. Các phƣơng pháp kiểm tra
3.2.4.1. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào nấm men
Để biết đƣợc mật độ nấm men cho vào môi trƣờng lên men vần đếm số lƣợng tế bào có trong 1ml. Vì kích thƣớc tế bào nấm men tƣơng đối lớn nên ta có thể đếm tực tiếp tế bảo trên kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu.
Tiến hành
Đặt lam kính lên khu vực buồng đếm. Lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet để lấy một giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi