Chúng tôi tiến hành xác định trình tự nucleotide của gen GmEXP1 phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn, kết quả đọc trình tự đƣợc đem phân tích xử lý bằng phần mềm DNAstar. Khi so sánh trình tự này trong BLAST
Thẳng Xoắn Siêu xoắn
của ngân hàng NCBI kết quả cho thấy đây là trình tự gen GmEXP1của đậu tƣơng với kích thƣớc mong muốn. Trình tự gen GmEXP1 của giống đậu tƣơng Xuân Lạng sơn (XLS) đầy đủ có cả exon và intron nhƣ vậy gen này không mã hoá liên tục mà gián đoạn (Hình 3.8).
Hình 3.8 cho thấy gen GmEXP1 có exon 1 từ vị trí nucleotide 11 đến 477; intron từ vị trí nucleotide 478 đến 777; exon 2 từ vị trí nucleotide 778 đến 1078. Từ 1 đến 10 là điểm vùng chứa điểm cắt của enzyme giới hạn NcoI ở mồi xuôi; từ 1079 đến 1090 là vùng chứa điểm cắt của enzyme giới hạn NotI ở mồi ngƣợc. Kích thƣớc exon 1 là 467 bp; exon 2 là 301 bp; intron là 300 bp. Nhƣ vậy gen GmEXP1 có kích thƣớc là 1068 nucleotide, trong đó vùng mã hóa dài 768 nucleotide.
Khi so sánh trình tự nucleotide của gen GmEXP1 phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn với trình tự nucleotide của gen GmEXP1 đậu tƣơng đã công bố với mã số trên ngân hàng gen NCBI là AF516879, kết quả so sánh đƣợc thể hiện ở hình 3.9. Trình tự nucleotide của gen GmEXP1 phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn so với trình tự nucleotide của gen GmEXP1
đậu tƣơng đã công bố có sự sai khác nhau ở 16 vị trí nucleotide kể từ bộ ba mở đầu ở các vị trí 262 (Gen Gm EXP1 ở Xuân Lạng Sơn là C còn gen
GmEXP1 mã số AF516879 là T). Ở vị trí 268 (XLS: G; AF516879: T), ở vị trí 307 (XL: A, AF516879: G), ở vị trí 309 (XLS: T; AF516879: A), ở vị trí 456(XLS: C; AF516879: T), ở vị trí 463 (XLS: T; AF516879: G), ở vị trí 465 (XLS: G; AF516879: C), ở vị trí 466 (XLS: T; AF516879: C), ở vị trí 527 (XLS: G; AF516879: A), ở vị trí 546 (XLS: T; AF516879G), ở vị trí 568 (XLS: T; AF516879: A), ở vị trí 572 (XLS: T; AF516879: C), ở vị trí 602 (XLS: G; AF516879: C), ở vị trí 603 (XLS: T; AF516879: A), ở vị trí 609(XLS: T; AF516879: A), ở vị trí 623(XLS: A; AF516879: C).
Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide vùng mã hóa của gen GmEXP1
phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn với trình tự nucleotide mã số AF516879 công bố trên NCBI
Hình 3.10 So sánh trình tự amino acid của proteinEXP1 do gen GmEXP1
mã hoá phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn với trình tự amino acid của protein EXP1 do gen có mã số AF516879 công bố trên NCBI.
Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein EXP1 đƣợc mã hoá bởi gen GmEXP1 phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn với trình tự amino acid của protein EXP1 do gen GmEXP1 mã hoá có mã số AF516879 công bố trên NCBI cho thấy có sự sai khác ở 8 vị trí amino acid trong chuỗi polypeptide lần lƣợt ở các vị trí 88 (XLS: H,AF516879: Y), Vị trí 91 (XLS: A,AF516879: S), ở vị trí 103 (XLS: I,AF516879: V), ở vị trí 155 (XLS: F,AF516879: V), ở vị trí 156 (XLS: V,AF516879: P), ở vị trí 191 (XLS: S,AF516879: F), ở vị trí 201 (XLS: G,AF516879: A), ở vị trí 208 (XLS: Y,AF516879: S).
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1.1. Các giống đậu tƣơng địa phƣơng nghiên cứu có sự phản ứng khác nhau với hạn thể hiện ở sự thay đổi số lƣợng rễ, chiều dài rễ qua các thời điểm hạn. 1.2. Phản ứng thích nghi của bộ rễ của các giống đậu tƣơng là khác nhau. Số lƣợng rễ con và chiều dài rễ có xu hƣớng tăng dần theo thời gian bị hạn. Tăng cao nhất là giống Xuân Lạng Sơn thấp nhất là Lơ Bắc Giang.Chỉ số chịu hạn tƣơng đối dao động từ 2548,61 đến 3179,25. Giống Xuân Lạng Sơn có khả năng chịu hạn cao hơn các giống khác.
1.3. Đã nhân bản, chọn dòng thành công gen GmEXP1 của giống đậu tƣơng chịu hạn tốt Xuân Lạng Sơn và giống đậu tƣơng chịu hạn kém Lơ Bắc Giang.
1.4. Đã xác định trình tự gen GmEXP1 phân lập từ giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn. Gen GmEXP1 có kích thƣớc là 1068 nucleotide, trong đó vùng mã hóa dài 768 nucleotide, với 2 exon và 1 intron. Kích thƣớc exon 1 là 467 bp; exon 2 là 301 bp; intron là 300 bp. Gen GmEXP1 mã hóa protein gồm 255 amino acid.
1.5. Trình tự gen GmEXP1 của giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn có 16 vị trí nucleotide sai khác so với trình tự gen GmEXP1 mang mã số AF516879 trên Ngân hàng gen Quốc tế; protein suy diễn của gen GmEXP1 của giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn có 8 vị trí amino acid sai khác so với protein của trình tự gen có mã số AF516879.
2. ĐỀ NGHỊ
Cần tiếp tục nhân bản, chọn dòng và đọc trình tự gen GmEXP1 và so sánh trình tự gen GmEXP1 của giống đậu tƣơng thuộc nhóm chịu hạn tốt và giống đậu tƣơng thuộc nhóm chịu hạn kém để tìm ra chỉ thị về gen liên quan đến khả năng kéo dài rễ cây đậu tƣơng, làm cơ sở nghiên cứu biện pháp công nghệ nhằm tăng cƣờng khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi của cây lúa, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội, 250 trang.
2. Lê Trần Bình và cs (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp Hà Nội
3. Ngô Thế Dân và cộng sự (1999), Cây đậu tƣơng, Nxb Nông Nghiệp.
4. Trần Thị Cúc Hoà (2007), Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tƣơng trồng ở Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn,
18, 11-16.
5. Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội ở Miền Bắc Việt Nam, Luận án PTS, Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Thuý Hƣờng, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cƣờng, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008), Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen P5CS của một số giống đậu tương, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4): 459-466. 7. Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng
Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “ Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill) phục vụ chuyển gen„, Tạp chí Khoa học &Công nghệ- ĐH Thái Nguyên, 52 (4): 82-88
8. Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, tr: 5-6.
9. Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
11. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội, tr: 20-215.
12. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội
13. Chu Hoàng Mậu, Nông Thị Man, Lê Trần Bình (2001), Đánh giá một số tính trạng kinh tế quan trọngvà khả năng chịu hạn của các dòng đậu tương (Glycine max (L.) Merril) Đột biến, Tạp chí Khoa học và Công nghệ,1(13),Đại Học Thái Nguyên,16-21.
14. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trongchọn giống cây trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên.
15. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng tế bào chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội, 134 trang.
16. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội.
17. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm (1994), Giáo trình sinh lí thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 1-228
18. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczeck), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
19. Bray E.A (1997), Plant responses to water deficit, Trends Plant Sci, 2, pp
20.Brummell DA,Harpster MH, Civello PM,Palys JM, Bennett AB, Dunsmuir P, (1 999a) Modification of expansin protein abundance in tomato fruit alters
softening and cell wall polymer metabolism during ripening. Plant Cell 11:2203–2216.
21.Cho H-T, Cosgrove DJ, (2000) Altered expression of expansin modulates leaf growth and pedicel abscission in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA97:9783–9788.
22.Cho H-T, Kende H, (1998) Tissue localization of expansins in deepwater rice. Plant J 15:805–812.
23. Chuang CF, Meyerowitz EM, (2000) Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA97:4985–4990.
24.Cosgrove DJ, (1996) Plant cell enlargement and the action of expansins. BioEssays 18:533–540.
25.Cosgrove DJ, (1998) Cell wall loosening by expansins. Plant Physiol 118: 333– 339.
26.Cosgrove DJ, (1999) Enzymes and other agents that enhance cell wall extensibility. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50:391–417.
27.Cosgrove DJ, (2000) Expansive growth of plant cell walls. Plant Physiol Biochem 38:109–124.
28. Cosgrove DJ, Li Z-C, (1993) Role of expansin in cell enlargement of oat coleoptiles. Plant Physiol 103:1321–1328.
29. Crowell DN, (1994) Cytokinin regulation of a soybean pollen allergen gene. Plant Mol Biol 25:829–835.
30.Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko .(2011)," Genom-Wide Expression Proling of Soy bean Root and Shoot Tissues under Dehydration Stress''.
31.Fleming AJ, Caderas D, Wehrli E, McQueen,Mason S, Kuhlemeier C, (1999) An alysis of expansin-induced morphogenesis on the apical meristem of
tomato. Planta208:166–174.
32.Fleming AJ, McQueen,Mason S, Mandel T, Kuhlemeier C, (1997) Induction of leaf primordia by the cell wall protein expansin. Science 276:1415–1418. 33.Gawel, Jarret(1991).“Genomic DNA isolation”.
www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/htm/dna.htm
34.Hasenstein KH,Evans ML, (1988) Effects of cations on hormone transport in primary roots of Zea. Plant Physiol 86:890–894.
35. Kasper, T.C., H.M. Taylor, and RM. Shibles. 1984. Taproot elongation r a t e s of Soybean cul t iva r s in the glasshouse and the i r
relation to field rooting depth. Crop Sci. 24:916-920.
36.Karen S. and John M. (1990), “Gene expression in respone to abscisic acid a nd osmotic stress”, The plant cell, 2, pp: 503-512.
37.Keller E, Cosgrove DJ, (1995) Expansins in growing tomato leaves. Plant J 8:795–802.
38.Lee DK, Ahn JH, Song SK, Choi SYD, Lee JS. (2011), Expression of an Expansin gene is corre lated with root elongation in soybean (441-744) Korea.
39.Li Y, Darley CP, Ongaro V, Fleming A, Schipper O, Baldauf SL,
40.Link BM, Cosgrove DJ, (1998) Acid-growth response and α-expansin in suspension cultures of bright yellow 2 tobacco. Plant Physiol 118:907–916. 41. Malgorzata G., Barbara Z. (2004), “Multifunctional role of plant cysteine
proteinases”, Acta Biochimica Polonica, 51(3), pp: 609-624.
42.McQueen-Mason SJ, (2002) Plant expansins are a complex multigene family with an ancient evolutionary origin. Plant Physiol 128:854–864.
43.Michael AJ, (1996) A cDNA from pea petals with sequence similarity to pollen allergen, cytokinin induced and genetic tumor specific genes: identification of a new family of related sequences. Plant Mol Biol 30:219–224.
44.Nong V H, Arahira M, Phan V C, Kim CS, Zhang D, Udaka K, Fukazawa C (1997),Glycine max cct-d gene (cDNA) for group II-chaperonin delta-subunit complete cds. Genbank/EBI/DDJB database, Acc. No AB00423
45. Ouvrard O., Cellier F., Ferrare K.,Tousch D., Lamaze T., Dupuis J.M. and Casse D.F. (1996), “Identification and expression of water stress- and abscisic acid- regulated genes in a drought-tolerant sunflower genotype”, Plant Molecular Biology, Volume 31, Number 4, pp: 819-829(46)
46.Park C.J., Shin R., Park J.M., Lee G.J., You J.S. and Paek K.H. (2002), “Induction of pepper cDNA encoding a lipid transfer protein during the resistance response to tobacco mosaic virus”, Plant Molecular Biology, Volume 48, Number 3, pp: 243-25.
47.Reinhardt D, Wittwer F, Mandel T, Kuhlemeier C, (1998) Localized
upregulation of a new expansin gene predicts the site of leaf formation in the tomato meristem.Plant Cell 10:1427–1437.
48.Rose JKC, Cosgrove DJ, Albersheim P, Darvill AG, Bennett AB, (2000) Detecti on of expansin proteins and activity during tomato fruit ontogeny. Plant Physiol123:1583–1592.
49. Rose JKC, Lee HH, Bennett AB, (1997) Expression of a divergent expansin gene is fruit-specific and ripening-regulated. Proc Natl Acad Sci USA 94:5955– 5960.
50. Schiefelbein JW, Masucci JD, Wang H, (1997) Building a root: the control of patterning and morphogenesis during root development. Plant Cell 9:1089– 1098.