2.2.5.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA từ lá đậu tƣơng
Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ lá đậu tương theo phương pháp của Gawel và đtg như sau:
(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nito lỏng thành bột mịn.
(2) Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
(3) Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. (4) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
(5) Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
(6) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng.
(7) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. (8) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ.
(9) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn. (10) Làm khô DNA bằng máy speed vac.
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phƣơng pháp:
(1) Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng.
Độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 đƣợc coi là đảm bảo chất lƣợng.
(2) Phƣơng pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
- Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ model 825-2A của hãng Hewlett- Packard và pha loãng về nồng độ sử dụng 10ng/µl.
2.2.5.2. Phân lập gen và xác định trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tƣơng
Kỹ thuật PCR
Sau khi tách chiết và kiểm tra đƣợc độ tinh sạch của DNA tiến hành nhân gen GmEXP1 bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và cs (1985) với cặp mồi đặc hiệu đƣợc trình bày trong bảng 2.2
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi nhân gen Gm EXP1
Mồi Trình tự mồi (5’-3’)
SoyExp-F CATGCCATGGATGGGCAAAATCATGCTTGT
Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.3 và bảng 2.3. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion khử trùng 11,0 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (2,5 mM) 2,0 5 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 6 Mồi ngƣợc (10 pM/µl) 2,0
7 Taq-polymerase (5U/1µl) 1,0
8 DNA mẫu 2,0
Tổng 25
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
30
3 Gắn mồi 54 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Sau đó,
sản phẩm đƣợc tinh sạch (thôi gel) theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas.
2.2.5.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm có kích thƣớc khoảng 350 bp cho vào ống eppendort 1,5 ml .
- Bổ sung 1000µl dung dịch Binding esdution. - Ủ ở 550
C trong khoảng 20 phút, 5 phút trộn nhẹ cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt.
- Bổ sung 5 - 10µl Silica power vào và ủ sản phẩm ở 550C khoảng 5 phút rồi vontex khoảng 2 phút.
- Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng. - Bổ sung tiếp khoảng 500µl Buffer wash, vontex 2 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để loại dịch nổi, thu tủa (bƣớc này lặp lại 3 lần).
- Làm khô DNA trong box.
- Hoà tan DNA trong 20µl H2O de ion khử trùng rồi ủ sản phẩm ở 550C trong 5 - 10 phút.
- Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa.
- Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
2.2.5.4. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT đƣợc thể hiện ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòngpBT STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion khử trùng 12,2 2 DNA 4 3 Ligation buffer 10X 2 4 Vector pBT 1 5 Enzyme T4 ligase 0,8 Tổng 20
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 1h, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT
2.2.5.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp vào đá trong 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút. Sau đó tiếp tục đặt hỗn hợp vào đá 5 phút. Bổ sung 400µl môi trƣờng LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200
vòng/phút trong 1 giờ ở 370C. Sử dụng que cấy trải, trải 200µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Sau đó, chọn những khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicillin) qua đêm.
2.2.5.6. Tách chiết plasmid
Sau khi kiểm tra sản phẩm clony-PCR tiến hành tách plasmid bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Các bƣớc tách chiết plasmid:
(1)Lấy dịch vi khuẩn li tâm 3000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch thu cặn.
(2)Hòa cặn trong 250 l Resuspension Buffer for plasmid (Buffer 1), đảo nhẹ.
(3)Bổ sung 250 l Lysis Buffer for plasmid (Buffer 2) vào ống trên, đảo nhẹ. (4)Bổ sung 350 l Neutralization Buffer for plasmid (Buffer 3), đảo nhẹ để tránh kết tủa cục bộ.
(5)Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột tinh sạch plasmid của hãng Bioneer.
(6)Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(7)Bổ sung 500 l Denaturation Buffer for plasmid (Buffer D), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(8)Bổ sung 700 l Washing Buffer for plasmid (Buffer 4), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(9)Đặt cột sang ống 1,5 ml mới, cho 20 l H2O vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút và li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu nhận plasmid.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.5.7. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide
Trình tự của gen đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.