1.3.4.1. Expansin
Expansin là một họ protein có chức năng mở rộng thành tế bào và đã đƣợc coi là loại protein chủ yếu có ảnh hƣởng đến việc kéo dài tế bào rễ ở
thực vật. Lee và đtg (2003) lần đầu tiên đã xác định đƣợc gen expansin ở cây đậu tƣơng (Glycine max)- GmEXP1 có thể đóng vai trò trong sự kéo dài rễ. Mức độ biểu hiện của GmEXP1 rất cao trong rễ của mầm 5 ngày tuổi. Hơn nữa, mRNA của gen GmEXP1 đƣợc tìm thấy nhiều nhất ở vùng gốc rễ và vùng tế bào kéo dài, nhƣng khan hiếm trong miền sinh trƣởng của rễ. Kết quả lai tại chỗ cho thấy GmEXP1 có nhiều ở các tế bào biểu bì là các lớp tế bào cơ bản trong rễ sơ cấp và thứ cấp. Gen GmEXP1 biểu hiện đã đẩy nhanh tốc độ kéo dài rễ của cây thuốc lá biến đổi gen (Nicotiana tabacum) ở điều kiện thiếu nƣớc cực đoan. Những kết quả thí nghiệm đã cho thấy gen GmEXP1 giữ vai trò quan trọng trong sự phát triển rễ đậu tƣơng, đặc biệt là trong sự kéo dài, hoặc bắt đầu ở thời điểm hình thành các rễ sơ cấp và thứ cấp [38].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng expansin chủ yếu đƣợc xem xét nhƣ là một tác nhân chính trong sự kéo dài thành tế bào, trong khi các chất khác cũng có thể sửa đổi cấu trúc vách tế bào và hỗ trợ sự kéo dài của vách tế bào. Tuy nhiên, vai trò chức năng của expansin trong sự kéo dài tế bào mới chỉ đƣợc nghiên cứu trong ống nghiệm mà ít thấy công trình nghiên cứu ở cơ thể tự nhiên (Link và Cosgrove, năm 1996, Fleming et al, 1997). Mặc dù cơ sở phân tử của sự hoạt động thay đổi vách tế bào của expansin vẫn còn chƣa đƣợc sáng tỏ, nhƣng hầu hết các bằng chứng đều cho thấy expansin là nguyên nhân gây ra sự dãn dài tế bào bằng cách nới lỏng các liên kết hydro giữa các microfibrils cellulose và mạng lƣới polymer (McQueen-Mason và Cosgrove, 1994 ; Cosgrove, 1997 ). Kể từ lần đầu tiên nhân bản gen expansin đƣợc công bố bởi Shcherban et al. (1995) và cho đến nay các gen expansin đã đƣợc nhiều tác giả phân lập từ một loạt các loài thực vật. Các gen expansin phân bố ở ba phân họ, đƣợc gọi là α, β, và γ (Li et al, 2002). α-expansins chiếm phần lớn của expansin, bao gồm cả những gen phân lập từ cà chua ( Lycopersicon
esculentum ;Keller và Cosgrove, năm 1995), lúa gạo (Oryza sativa ; Cho và Kende, 1997), yến mạch (Avena sativa ; Li et al, 1993), và cây Arabidopsis ( Cosgrove, năm 1998 , Li et al, 2002 ). Theo đề nghị của Cosgrove (1998) thì phân họ α-expansin có thể đƣợc chia thành các nhóm A, B, C, và D. Mô hình biểu hiện của gen α-expansin đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi ở cây lúa nƣớc (Cho và Kende, 1997 ) và cà chua (Reinhardt et al, 1998 ; Brummell et al, 1999 ). Kết quả đánh giá sự biểu hiện của gen OsEXP4 ở cây lúa nƣớc cho thấy sản phẩm biểu hiện của gen expansin đã tăng hàm lƣợng trƣớc khi bắt đầu mở rộng thành tế bào và hỗ trợ việc kéo dài tế bào (Cho và Kende, 1998). Ở cà chua, biểu hiện của gen LeEXP18 đã đƣợc khu vực hoá ở một nhóm các tế bào trong mô phân sinh chồi ngọn (Reinhardt et al., 1998). Nhƣ vậy, sự biểu hiện các LeEXP18 đƣợc coi nhƣ là một dấu hiệu phân tử trong sự hoạt động của lá cây, dự đoán có thể đƣợc phát hiện trong mô phân sinh đỉnh chồi (Reinhardt et al, 1998). Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng biểu hiện LeEXP18 không tƣơng quan với mức tăng trƣởng kéo dài và một số gen expansin ở cà chua lại biểu hiện trong quá trình phát triển của quả, nhƣ vậy không phải tất cả các expansin đều tham gia trong quá trình giãn dài của tế bào (Brummell et al, 1999; Caderas et al, 2000; Rose et al, 2000). Sự phức tạp của họ expansin thể hiện ở chỗ các expansin khác nhau có thể đóng vai trò khác nhau ở các loại tế bào trong quá trình phát triển các cơ quan bộ phận của cây (Rose et al, 1997; Reinhardt et al, 1998) [20], [24], [25], [31], [32], [37], [38], [39], [40], [42], [47], [48], [49], [50].
1.3.4.2. Gen GmEXP1 ở cây đậu tƣơng
Sự kéo dài tế bào gây ra bởi môi trƣờng có tính axit và expansin với vai trò mở rộng thành tế bào đã tìm thấy ở tảo, rêu, dƣơng xỉ, cây hạt trần và cây hạt kín, cho nên có thể coi expansin giữ vai trò trong việc làm giãn dài tế bào
(Cosgrove, 1996). GmEXP1, GmEXP2 và expansins khác trong họ expansin có độ tƣơng đồng cao, chỉ khác ở hàm lƣợng acid amin (http://www.plantphysiol.org ). Nhiều gen đã đƣợc phân lập từ một loạt các loài thực vật và kết quả thu đƣợc đã chỉ ra rằng chúng tạo thành một họ expansin multigene (Cosgrove, 1998 ). Li et al.(2002) và gần đây đã phân loại expansin thành ba phân họ α-, β-và γ-expansin, dựa trên mối quan hệ phát sinh loài của chúng. Link và Cosgrove (1998) cũng đã phân loại trƣớc đó các phân họ α-expansin thành bốn nhóm. Phân tích sự phát sinh loài Lee và đtg chỉ ra rằng GmEXP1 thuộc nhóm D, trong đó bao gồm NtEXP3 ( Link và Cosgrove, năm 1998 ), OsEXP1 (Cho và Kende, 1997 ), và CsEXP2 ( Shcherban et al., 1995 ), trong khi GmEXP2 thuộc nhóm A, trong đó bao gồm AtEXP6 (Shcherban et al, 1995), PsEXP1 ( Michael, năm 1996 ), và LeEXP18 ( Reinhardt et al, 1998 ; http://www.plantphysiol.org ). Các trình tự bảo tồn cao giữa các expansins khác nhau từ các cây một lá mầm và hai lá mầm, chẳng hạn nhƣ lúa, dƣa chuột, Arabidopsis, hạt đậu, và đậu tƣơng, có thể hỗ trợ một số điểm quan trọng: (a) Các họ gen expansin đã phát sinh bởi gen nhân bản trƣớc khi phân kỳ tiến hóa của cây một lá mầm và cây hai lá mầm khoảng 150 triệu năm trƣớc, (b) protein expansin có vai trò sửa đổi cấu trúc trong khi có thể duy trì chức năng; và (c) các chức năng của chúng là rất quan trọng để phát triển bình thƣờng và sinh lý của cây hạt kín (Shcherban et al, 1995 ). Kết quả nghiên cứu của Lee và đtg (2008) khi phân tích RNA bằng Northern blot cho thấy rằng gen GmEXP1 đƣợc biểu hiện mạnh ở rễ, đặc biệt khi quá trình hình thành các rễ chính và rễ phụ. Hơn nữa, ở mầm 5 ngày tuổi, sự tăng trƣởng của rễ chính giảm và các rễ phụ lai đƣợc phát triển mạnh. Những kết quả nghiên cứu cho rằng gen GmEXP1 có liên quan đến sự kéo dài rễ cây đậu tƣơng. Phân tử mRNA của gen GmEXP1 thƣờng đƣợc các
khu vực hóa với các lớp tế bào biểu bì và nằm dƣới ở vùng kéo dài của rễ sơ cấp ở đậu tƣơng.
Kết quả các thí nghiệm khác cũng chỉ ra rằng gen GmEXP1 chủ yếu thể hiện ở các vùng phân chia tế bào và kéo dài của rễ sơ cấp và thứ cấp. Kết quả lai tại chỗ cho thấy GmEXP1 xuất hiện nhiều ở vùng gốc rễ sơ cấp và thứ cấp. Gen GmEXP1 biểu hiện ở các tế bào trong lớp biểu bì và các lớp tế bào cơ bản của khu vực kéo dài của rễ chính. Các kết quả nghiên cứu về gen
GmEXP1 đã gợi ý rằng sự biểu hiện của gen GmEXP1 xảy ra trong thời gian và không gian xác định của quá trình phát triển của rễ cây đậu tƣơng.
Hiện nay, vai trò của expansin trong quá trình phát triển rễ của cây đậu tƣơng vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ mặc dù đã có nhiều nỗ lực nghiên cứu. Tuy nhiên, hƣớng tiếp cận nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển của rễ là sự tham gia của các protein trong quá trình cải thiện thành tế bào trong các lớp tế bào biểu bì rễ, trong việc điều hành các hoạt động kéo dài và trƣởng thành của cây cũng sẽ đƣợc quan tâm (Hasenstein và Evans, 1988). Hầu hết sự gia tăng chiều dài rễ bắt đầu từ sự kéo dài tế bào ở vùng sinh trƣởng của rễ. Ban đầu thể hiện rõ ở các rễ sơ cấp, sau đó thì sự biểu hiện này giảm dần và cây càng lớn sự biểu hiện của Gm EXP1 càng thấy rõ rệt ở khu vực rễ thứ cấp [21], [22], [28], [29], [34], [38], [39], [41], [43], [47], [48], [49].
Phân tích trình tự nucleotid của gen GmEXP1 cho thấy gen GmEXP1 có số lƣợng nucleotid 1089 bp, từ vị trí nucleotid thứ 1 đến 1089, vùng mã hóa có 768 nucleotid từ nucleotide 52 đến nucleotide 819 (Lee và đtg, 2003) (Hình 1.1)
Hình 1.1. Trình tự của vùng mã hóa của gen GmEXP1 ở đậu tƣơng
Sơ đồ ở hình 1.2 trình bày về gen GmEXP1 và protein với hai vùng chức năng của protein EXP1 ở cây đậu tƣơng là DPBB và Pollen allerg.
Gen GmEXP1 có kích thƣớc phân tử là 1089 bp, mã hóa cho 255 acid amin, từ vị trí số 1 đến vị trí amino acid thứ 255.
1 mgkimlvlgs liglccftit tyafspsgwt nahatfyggs dasgtmggac gygnlyatgy 61 gtrtaalsta lfndgascgq cykiicdyks dsrwcikgrs vtvtatnfcp pnfalpnnng 121 gwcnpplkhf dmaqpaweki giyrggivpv lfqrvpckkh ggvrfsvngr dyfelvlisn 181 vggagsiqsv fikgsktgwm amsrnwgsnw qsnaylngqs lsfrvtttdg etrvfqdivp 241 vswtfgqtfs spvqf
Hình 1.3. Trình tự amino acid do gen GmEXP1 mã hoá
Khi phân tích về trình tự chuỗi protein EXP1, chúng tôi nhận thấy protein này chứa một vùng bảo thủ DPBB và vùng Pollen allerg. Vùng DPBB có 91 amino acid, từ vị trí amino acid 64 đến 152 (Hình 1.3). DPBB là một vùng bảo thủ của Rare Lipoprotein A (RlpA) có cấu trúc bởi hai chuỗi dạng cuộn gấp kiểu beta (DPBB). Chức năng của RlpA đến nay vẫn chƣa đƣợc làm rõ, nhƣng hoạt động của nó đã đƣợc chứng minh nhƣ một chất kìm hãm sự phát sinh đột biến ở E.coli. Khúc cuộn DPBB thƣờng là một miền enzyme và các thành viên của họ DPBB là khá đa dạng và mỗi dạng DPBB có thể có một số chức năng khác nhau.
Vùng Pollen allerg có 77 amino acid từ vị trí amino acid số 163 đến vị trí amino acid 240 (Hình 1.4).
Hình 1.5. Trình tự amino acid của vùng Pollen allerg của protein EXP1
Hình 1.6. Mô hình cấu trúc không gian vùng Pollen allerg của protein EXP1
Nhƣ vậy việc nghiên cứu về gen GmEXP1 làm cơ sở nghiên cứu cơ chế kháng hạn của cây đậu tƣơng, tạo tiền đề nghiên cứu biện pháp công nghệ nhằm tăng cƣờng khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng và nâng cao năng suất, chất lƣợng sản phẩm đậu tƣơng Việt Nam.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU