4.1. Giai ựoạn vào mẫu
đây là công ựoạn ựầu tiên của quy trình nuôi cấy mô một loài cây, nhiệm vụ của công ựoạn này là phải ựưa ựược nguồn mẫu từ ngoài môi trường vào nuôi cấy trong ựiều kiện vô trùng, tạo vật liệu khởi ựầu cho các công việc tiếp theo. Vì vậy, nó có ý nghĩa quyết ựịnh ựến sự thành bại của việc nuôi cấy, với nhiều loài cây thì vào ựược mẫu coi như ựã thành công ựược một nửa. để có ựược nguồn vật liệu khởi ựầu sạch vi sinh vật, thông thường cần phải sử dụng các chất hoá học có tắnh sát trùng mạnh như Ca(HClO)2, HgCl2, NaOCl, hoặc H2O2 ựể khử trùng mẫu. Về nguyên tắc, ựối với mỗi loài cây, mỗi loại mẫu cấy sẽ có nồng ựộ chất khử trùng, thời gian khử trùng và phương pháp khử trùng khác nhau. Việc lựa chọn ra một chế ựộ khử trùng thắch hợp có ý nghĩa quan trọng ựối với các giai ựoạn sau trong nhân giống in vitro. Do vậy, trong giai ựoạn tạo nguồn mẫu ban ựầu của cây ba kắch, tôi tiến hành nghiên cứu xác ựịnh ảnh hưởng của loại hoá chất khử trùng, thời gian khử trùng và phương pháp khử trùng (ựơn và kép) ựến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy. Dưới ựây là những kết quả chắnh thu ựược.
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng trong thuỷ ngân clorua (HgCl2) 0,1% ựến khả năng khử trùng mẫu cấy. (HgCl2) 0,1% ựến khả năng khử trùng mẫu cấy.
Thuỷ ngân clorua (HgCl2) là một chất có tắnh sát thương mạnh, nồng ựộ sử dụng từ 0,1-1% tuỳ thuộc và từng loại mẫu cấy. Ở thắ nghiệm này, tôi tiến hành khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 nồng ựộ 0,1% ở các mốc thời gian khác nhau, kết quả thu ựược như sau:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong HgCl2 0,1% ựến khả năng khử trùng mẫu cấy
Chỉ tiêu theo dõi
CT Hoá chất Hoá chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) 1 HgCl2 0,1% 5 31,1 36,7 32,2 2 HgCl2 0,1% 7 12,2 46,7 41,1 3 HgCl2 0,1% 10 0,0 81,1 18,9 CV (%) 3,0 2,5 2,5 LSD (5%) 5.0 2,0 3,6
Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.1 cho thấy:
Dung dịch HgCl2 0,1% có hoạt tắnh khử trùng khá cao, thể hiện ở thời gian khử trùng 5 ựến 10 phút cho tác dụng tỷ lệ mẫu vô trùng thu ựược từ 18,9% ựến 41,1%, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp: 0% ựến 31,1%. Tuy nhiên dung dịch HgCl2 0,1% cũng có tắnh sát thương mạnh, khi tỷ lệ mẫu sống, vô trùng tăng lên từ 32,2% ựến 41,1% theo thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu bị chết do hóa chất gây ra cũng tăng theo tỷ lệ thuận, ở thời gian khử trùng 10 phút tỷ lệ mẫu nhiễm là 0%, tỷ lệ mẫu chết cao, 81,1%.
Ở thắ nghiệm này kết quả khử trùng ựạt tốt nhất ở CT2, khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút, tỷ lệ mẫu sống vô trùng thu ựược là cao nhất, ựạt 41,1%.
4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong canxi hypoclorit Ca(HClO)2 10% ựến khả năng khử trùng mẫu cấy. hypoclorit Ca(HClO)2 10% ựến khả năng khử trùng mẫu cấy.
Bên cạnh thuỷ ngân clorua, canxi hypoclorit Ca(HClO)2 cũng là một chất khử trùng thường ựược dùng trong nuôi cấy mô. Kết quả thắ nghiệm với canxi hypoclorit ựược thể hiện ở bảng 4.2:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong Ca(HClO)2 10% ựến khả năng khử trùng mẫu cấy
Chỉ tiêu theo dõi CT Hoá chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) 1 Ca(HClO)2 10% 10 85,5 0,0 14,5 2 Ca(HClO)2 10% 15 67,1 12,5 20,4 3 Ca(HClO)2 10% 20 55,3 22,7 32,0 CV (%) 3,2 4,6 4,9 LSD (5%) 5,0 3,1 5,0
Kết quả bảng 4.2 cho thấy:
Khi sử dụng hoá chất khử trùng là Ca(HClO)2 10%, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm khi thời gian khử trùng tăng lên. Ở công thức 1 khi sử dụng Ca(HClO)2 10% trong thời gian 10 phút tỷ lệ mẫu nhiễm 85,55%, tỷ lệ mẫu sống, vô trùng là 14,5%, không có mẫu nào chết. Ở công thức 2, khi tăng thời gian lắc Ca(HClO)2
lên 15 phút, tỷ lệ mẫu nhiễm giảm còn 67,1%, tỷ lệ mẫu chết tăng lên 12,5%, tỷ lệ mẫu sống ựạt ựược 20,4%. Ở công thức 3, khi tăng thời gian lắc Ca(HClO)2
lên 20 phút, tỷ lệ mẫu chết là 22,7%, tỷ lệ mẫu sống thu ựược là 32%.
Từ kết quả thắ nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy khi sử dụng chất khử trùng là Ca(HClO)2 10% tỷ lệ mẫu sống ựạt ựược là thấp hơn so với HgCl2 0,1% (tỷ lệ vào mẫu cao nhất chỉ ựạt 32%)
4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng kép (kết hợp giữa HgCl2 0,1% và Ca(HClO)2 10%) ựến khả năng khử trùng mẫu cấy. giữa HgCl2 0,1% và Ca(HClO)2 10%) ựến khả năng khử trùng mẫu cấy.
Qua 2 thắ nghiệm trên chúng tôi nhận thấy, trong 2 loại hoá chất khử trùng HgCl2 0,1% và Ca(HClO)2 10% mỗi loại có ưu nhược ựiểm riêng:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
- đối với HgCl2 0,1%: ưu ựiểm là có tắnh sát khuẩn cao nhưng nhược ựiểm là có tắnh sát thương gây chết mẫu mạnh. Khử trùng bằng HgCl2 0,1% nếu chỉ cần quá thời gian quy ựịnh một chút thì mẫu thu ựược tuy ựã ựược vô trùng nhưng lại bị chết do sát thương.
- đối với Ca(HClO)2 10%: ưu ựiểm là ựộ sát thương gây chết mẫu thấp mặc dù thời gian khử trùng dài. Nhược ựiểm là chỉ diệt ựược nấm, ắt có khả năng diệt ựược khuẩn.
Xuất phát từ vấn ựề trên, tôi tiến hành thắ nghiệm khử trùng kép bằng cách khử trùng lần 1 bằng Ca(HClO)2 10% ở các thời gian khác nhau (10 ; 15 và 20 phút) sau ựo khử trùng tiếp lần 2 bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút với mục tiêu nâng cao tỷ lệ khử trùng. Kết quả thắ nghiệm ựược cho ở bảng 4.3:
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng kép (kết hợp giữa HgCl2 0,1% và Ca(HClO)2 10%) ựến khả năng khử trùng mẫu cấy .