3. đỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2.Phương pháp nghiên cứu.
Cách bố trắ thắ nghiệm:
Thắ nghiệm ựược bố trắ theo khối ngẫu nhiên ựầy ựủ RCB (Randomizer Complete Blocks) 3 lần nhắc lại, mỗi lần 30 - 300 mẫu tuỳ từng thắ nghiệm.
3.2.2.1. Giai ựoạn nuôi cấy in vitro
* Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro.
+ Môi trường thắ nghiệm: MS (Muraskige & Skoog, 1962). Sử dụng các chất ựiều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin.
+ Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là 5,8 - 6,0. + Thể tắch dung dịch dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy) trong bình nuôi cấy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
150 ml
+ Môi trường ựược hấp khử trùng ở áp suất 1,1atm, nhiệt ựộ 1210C trong 25 phút.
+ điều kiện nuôi cấy:
- Chế ựộ chiếu sáng: 14 giờ sáng/10 giờ tối. - Cường ựộ chiếu sáng: 2.000 Ờ 2.500 lux. - Nhiệt ựộ phòng nuôi cấy 25 ổ 20C * Khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy ựược chọn là chồi ựỉnh hoặc chồi nách mang mắt ngủ ựược lấy từ các cây vật liệu sạch bệnh, khoẻ mạnh, sinh trưởng tốt. Mẫu ựược cắt bằng dao hoặc kéo sắc rồi cho ngay vào cốc nước sạch ựể tránh hiện tượng sặc bọt khắ làm tắc mạch dẫn, sau ựó ựem vào rửa sạch bằng nước xà phòng loãng dưới vòi nước chảy và tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất. Xử lý sơ bộ bằng cồn 70% trong 60 giây sau ựó tiến hành các bước khử trùng bằng HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 10% theo 2 phương pháp là khử trùng ựơn và khử trùng kép ở các thời gian khác nhau.
- Khử trùng ựơn: Khử trùng một lần bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5; 7; 10 phút hoặc bằng Ca(OCl)2 trong thời gian 10; 15; 20 phút.
- Khử trùng kép: Lần 1 khử trùng bằng Ca(OCl)2 trong thời gian 10; 15; 20 phút. Sau ựó rửa mẫu bằng nước cất ựã ựược khử trùng và tiến hành khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút.
Trong quá trình khử trùng, tiến hành lắc ựều ựể ựảm bảo mẫu cấy ựược tiếp xúc với dung dịch khử trùng. Mẫu cấy sau khi khử trùng ựược cấy vào vào nền môi trường: MS + 30 g/l ựường + 5 g/l agar ựể theo dõi.
* Phương pháp tái sinh chồi từ mẫu cấy
Những mẫu vô trùng, còn sống sau khử trùng ựược sử dụng làm mẫu vật ựể cấy vào môi trường có bổ sung các chất ựiều tiết sinh trưởng nhằm tái
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
sinh các chồi, cụm chồi ở ựỉnh sinh trưởng hoặc nách lá, các chồi bất ựịnh làm nguyên liệu ựể ựưa vào những nghiên cứu tiếp theo.
* Phương pháp nhân nhanh
Sau một thời gian nuôi cấy, khi các chồi ựủ lớn, chúng ựược tách khỏi mẫu cấy ban ựầu và ựược cấy vào môi trường nhân nhanh chứa trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 3-5 chồi ựể tạo cụm chồi. Môi trường nhân nhanh ựược bổ sung các chất ựiều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin ở các nồng ựộ khác nhau ựể ựạt ựược hệ số nhân nhanh cũng như chất lượng chồi là tốt nhất. Chu kỳ cấy chuyển ở giai ựoạn nhân nhanh ựịnh kỳ 45 ngày/lần.
* Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
Sau giai ựoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 2,5 Ờ 3 cm, sinh trưởng và phát triển bình thường ựược cắt cấy vào môi trường ra rễ ựể tạo thành cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ ựược bổ sung các chất ựiều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin ở các nồng ựộ khác nhau ựể kắch thắch chồi tạo rễ bất ựịnh, hình thành cây hoàn chỉnh với ựủ thân, lá, rễ ựể có khả năng chuyển từ sống dị dưỡng trên môi trường nhân tạo sang sống tự dưỡng khi ựược ựưa ra ngoài vườn ươm.
3.2.2.2. Giai ựoạn sau in vitro
* Chuẩn bị giá thể
- Bầu ựất: đất (tầng B, ựất cát pha) sau khi tập kết tại vườn ươm ựược ựập nhỏ và dùng sàng có kắch thước ựường kắnh mắt sàng 4mm ựể sàng loại bỏ rễ cây, sỏi ựá, rác, sau ựó ựóng vào bầu kắch thước 8 x 13cm.
- Bầu hữu cơ: Vật liệu hữu cơ ựược nghiền trộn và ựóng (hoàn toàn cơ giới hóa) vào bầu sợi vải dệt kắch thước 8 x 13cm.
* Xử lý giá thể.
Dùng dung dịch KMnO4 nồng ựộ 1-2% (tuỳ thuộc vào ựiều kiện thời tiết) tưới lên bề mặt sao cho thuốc ngấm vào lớp ựất bề mặt ≥ 2cm, ựể 8-12
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
giờ rồi dùng nước sạch rửa lại rồi mới cấy cây. * Cấy, chăm sóc cây. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Cấy cây:
- Ngay sau khi ra ngôi cây ựược cấy trên giá thể;
- Che chắn: khi cấy cây xong dùng vòm che phủ nylon và lưới che râm ựể hạn chế bớt cường ựộ sáng và ựảm bảo ựộ ẩm giúp cho cây không bị mất nước. Lưới che râm có ựộ tàn che 70%.
+ Tưới nước
- Thời kỳ ựầu mới cấy phun tưới 3 lần/ngày tuỳ thuộc vào thời tiết và khắ hậu, lượng nước tưới 2-3 lắt/m2/lần.
- Sau 1 tháng giảm số lần tưới xuống 2 lần/ngày, lượng nước tưới tăng lên 5-6 lắt/m2/lần.
+ Bón thúc
Sau 15-20 ngày bắt ựầu tưới thúc bằng phân bón: NPK đầu Trâu với nồng ựộ tăng dần: từ 0,4%-0,8%,1,0%. định kỳ 10 ngày/lần.
3.2.2.3. Chỉ tiêu theo dõi
* Chỉ tiêu theo dõi trong phòng thắ nghiệm:
Quan sát sự biến ựổi hình thái, màu sắc của mẫu cấy, hình thái của chồi, rễ. Tổng số mẫu sống
Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy ban ựầu
Tổng số mẫu nhiễm
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
Tổng số mẫu chết
Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy ban ựầu
Tổng số mẫu bật chồi
Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy ban ựầu
Tổng số chồi mới Hệ số nhân chồi (lần) =
Tổng số mẫu ban ựầu
Tổng số chiều cao chồi Chiều cao trung bình chồi (cm) =
Tổng số chồi Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ ra rễ (%) = x 100 Tổng số chồi cấy Tổng số rễ Số rễ bình quân/chồi (rễ) = Tổng số chồi cấy Tổng số chiều dài rễ
Chiều dài trung bình rễ (cm) =
Tổng số cây
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
Quan sát hình thái, màu sắc cây (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng số cây sống Tỷ lệ sống (%) = x 100 Tổng số cây cấy
Tổng số chiều cao cây Chiều cao bình quân cây (cm) =
Tổng số số cây
3.2.2.4. Phương pháp theo dõi
- đối với các thắ nghiệm vào mẫu: các chỉ tiêu theo dõi ựược quan sát và ựo ựếm 1 lần sau 30 ngày, các thắ nghiệm giai ựoạn nhân nhanh sau 45 ngày, các thắ nghiệm ra rễ theo dõi sau 20, 30 ngày từ khi cấy vào bình rễ.
- đối với thắ nghiệm ngoài vườn ươm: theo dõi 1 lần sau 60 ngày trồng.
3.2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu ựược xử lý thống kê trên máy tắnh theo chương trình Excel và IRRISTART ver 4.0.