4. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.3.1. Chế và thử nghiệm chiết xuất từ hạt Na và hạt cây Củ đậu trong
phòng thí nghiệm
Tiến hành thí nghiệm theo phƣơng pháp đã trình bày ở trên thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.1.1. Thí nghiệm xác định môi trường chiết xuất thích hợp cho từng loại dược liệu
a) Kết quả kiểm tra độc tính của dịch chiết phôi hạt Na sau 24 giờ trong các môi trường chiết xuất khác nhau
Kết quả kiểm tra độc tính các dạng bào chế dịch chiết phôi hạt Na sau 24 giờ trong các môi trƣờng chiết xuất khác nhau đƣợc tổng kết ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết phôi hạt Na 10% sau 24 giờ trong các môi trường
Loại dung môi chiết xuất
Thời gian gây chết 50% số ve thí nghiệm (phút)
Thời gian gây chết 100% số ve thí nghiệm (phút) NaOH 5% 72 126 HCl 5% 115 143 Cồn 400 135 205 Nƣớc ngâm 228 250
Đối chứng Ve thí nghiệm không chết trong suốt thời gian thí nghiệm Kết quả bảng 3.9 cho thấy: Dịch chiết phôi hạt Na 10% ngâm 24 giờ trong các môi trƣờng chiết xuất khác nhau đều có tác dụng đối với ve chó thí nghiệm, trong khi đó ở các lô đối chứng tất cả ve chó vẫn bình thƣờng, không con nào chết. Tuy nhiên độc tính của các dạng bào chế trên ve chó thí nghiệm có khác nhau, thể hiện ở thời gian gây chết 50% và 100% ve chó thí nghiệm. So sánh 4 dạng bào chế trên thì dịch chiết phôi hạt Na đã đƣợc làm ẩm bằng NaOH 5% có độc tính cao nhất vì thời gian gây chết ve chó thí nghiệm là ngắn nhất, sau đó đến dịch chiết phôi hạt Na đã đƣợc làm ẩm bằng HCl 5%, cồn 400
và cuối cùng là dạng nƣớc ngâm.
Cụ thể độc tính của 4 dạng dịch chiết phôi hạt Na ở nồng độ 10%, thời gian ngâm chiết 24 giờ đối với ve chó thí nghiệm nhƣ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thời gian gây chết 50% số ve chó sau khi tiếp xúc với dịch chiết phôi hạt Na đã đƣợc làm ẩm bằng NaOH 5%, HCl 5%, cồn 400, nƣớc cất lần lƣợt tƣơng ứng là: 72, 115, 135 và 228 phút. Các dạng dịch chiết trên giết chết 100% số ve chó thí nghiệm sau: 126, 143, 205 và 250 phút.
Quan sát các biểu hiện của ve chó thí nghiệm khi dùng dịch chiết phôi hạt Na ở nồng độ 10%, thời gian ngâm chiết 24 giờ đối trong môi trƣờng NaOH 5% nhận thấy: Khi mới tiếp xúc do phản xạ ve tạm ngƣng hoạt động, sau đó nhanh chóng trở lại trạng thái ban đầu. Ve tăng tốc độ bò trong vài phút. Khi thuốc đã ngấm vào cơ thể qua đƣờng tiêu hóa, hô hấp, da do tiếp xúc ve hoạt động yếu dần, lờ đờ, chậm chạp, chân co rút. Khi chết, chân ve duỗi, những con hút máu no cơ thể bị tím đen.
Tóm lại: Ve ký sinh ở chó mẫn cảm với dịch chiết phôi hạt Na trong cả 4 loại môi trƣờng, Có 100% số ve thí nghiệm chết trong vòng 126 - 250 phút. Ve chó chết trong môi trƣờng hạt Na chiết xuất bằng NaOH 5% nhanh nhất (126 phút).
Kết luận: So sánh độc tính của dịch chiết phôi hạt Na 10% sau 24 giờ trong 4 loại môi trƣờng NaOH 5%, HCl 5%, cồn 400
, nƣớc cất chúng tôi thấy:
Với cùng một thời gian ngâm chiết nhƣ nhau, cùng một nồng độ nhƣng khác nhau về dung môi chiết xuất nên độc tính của phôi hạt Na với ve chó thí nghiệm cũng khác nhau. Trong 4 loại dung môi kể trên, dịch chiết phôi hạt Na đƣợc làm ẩm bằng NaOH 5% có tác dụng mạnh nhất đối với ve chó.
Kết quả thí nghiệm xác định độc tính của dịch chiết phôi hạt Na 10% sau 24 giờ ở bảng 3.9 đƣợc minh họa bằng hình 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.1. Biểu đồ kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết phôi hạt Na 10% sau 24 giờ trong các môi trường
Nhìn vào hình 3.1 thấy ve chó rất mẫn cảm với dịch chiết phôi hạt Na trong môi trƣờng NaOH 5%.
Nhƣ vậy phôi hạt Na ở các dạng chiết xuất khác nhau đều có tác dụng diệt ve chó. Tuy nhiên tốt nhất vẫn là dịch chiết bằng môi trƣờng NaOH 5%.
b)Kết quả kiểm tra độc tính của dịch chiết hạt Củ đậu sau 24 giờ trong các môi trường chiết xuất khác nhau
Tiến hành thí nghiệm kiểm tra độc tính của dịch chiết hạt Củ đậu sau 24 giờ trong các môi trƣờng chiết xuất khác nhau với ve chó tƣơng tự nhƣ thí nghiệm kiểm tra độc tính dịch chiết phôi hạt Na sau 24 giờ trong các môi trƣờng chiết xuất khác nhau, thấy ve cũng có những biểu hiện: mới đầu tạm ngƣng hoạt động, sau đó nhanh hơn, bị kích thích mạnh. Khi thuốc đã ngấm vào cơ thể qua đƣờng tiêu hóa, hô hấp, da do tiếp xúc ve hoạt động yếu dần, lờ đờ, chậm chạp, chân co rút rồi chết.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả kiểm tra độc tính các dạng bào chế dịch chiết hạt Củ đậu sau 24 giờ trong các môi trƣờng chiết xuất khác nhau đƣợc tổng kết ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết hạt Củ đậu 5% sau 24 giờ trong các môi trường
Loại dung môi chiết xuất
Thời gian gây chết 50% số ve thí nghiệm (phút)
Thời gian gây chết 100% số ve thí nghiệm (phút) NaOH 5% 25 35 HCl 5% 50 80 Cồn 400 120 150 Nƣớc ngâm 185 210
Đối chứng Ve thí nghiệm không chết trong suốt thời gian thí nghiệm Kết quả bảng 3.10 cho thấy: Dịch chiết hạt Củ đậu ngâm 24 giờ trong các môi trƣờng khác nhau cũng thể hiện độc tính khác nhau đối với ve chó thí nghiệm. Trong số các môi trƣờng chiết xuất: NaOH 5%, HCl 5%, cồn 400
, nƣớc ngâm thì môi trƣờng NaOH 5% cho kết quả tốt nhất, thể hiện bằng thời gian chết ve chó thí nghiệm ngắn nhất. Dạng nƣớc ngâm ít có độc tính nhất với ve chó thí nghiệm.
Quan sát thí nghiệm thấy rằng: Khi chiết hạt Củ đậu bằng NaOH 5% sẽ có tác dụng diệt ve tốt, có 50% ve chó chết trong 25 phút, 100% chết trong 35 phút. Ở các môi trƣờng chiết xuất khác cũng diệt đƣợc 100% số ve chó thí nghiệm từ 80 đến 210 phút. Kết quả đƣợc minh họa bằng hình 3.2.
Nhìn vào hình 3.2 thấy ve chó rất mẫn cảm với dịch chiết hạt Củ đậu đƣợc chiết bằng NaOH 5%. Nhƣ vậy môi trƣờng chiết xuất tốt nhất với hạt Củ đậu là NaOH 5%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.2. Biểu đồ kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết hạt Củ đậu 5% sau 24 giờ trong các môi trường
Kết quả này hoàn toàn logic với nghiên cứu của một số tác giả trƣớc đây. Theo Đỗ Tất Lợi (2000) [19] trong hạt Củ đậu có chất độc Rotenon đƣợc xếp vào nhóm Izoflavon. Mặt khác theo Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho (1994) [9]: trong công thức cấu tạo của Izoflavon có chứa phenol vì vậy dễ tan trong dung dịch kiềm loãng. Nhƣ vậy dịch chiết hạt Củ đậu đã đƣợc làm ẩm bằng NaOH 5% chứa nhiều Rotenon hòa tan hơn các dạng dịch chiết còn lại nên có độc tính với ve chó thí nghiệm cao hơn hẳn.
Tóm lại, qua kết quả kiểm tra độc tính các dịch chiết phôi hạt Na và hạt Củ đậu sau 24 giờ trong các môi trƣờng chiết xuất khác nhau đã xác định đƣợc môi trƣờng chiết xuất tốt nhất với hai loại dƣợc liệu này là NaOH 5%. Chọn môi trƣờng này để ngâm chiết dƣợc liệu, tiến hành các thí nghiệm tiếp theo, xác định thời gian chiết xuất thích hợp đối với từng loại dƣợc liệu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.1.2. Thí nghiệm xác định thời gian chiết xuất thích hợp với từng loại dược liệu
a) Xác định thời gian chiết xuất thích hợp của hạt Na trong môi trường NaOH 5%
Kết quả thí nghiệm trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết phôi hạt Na 10% trong môi trường NaOH 5% tại các thời điểm chiết xuất
Thời gian chiết xuất (giờ)
Thời gian gây chết 50% số ve thí nghiệm (phút)
Thời gian gây chết 100% số ve thí nghiệm (phút) 12 78 130 24 72 126 36 65 120 48 75 135 60 90 160
Đối chứng Ve thí nghiệm không chết trong suốt thời gian thí nghiệm Kết quả bảng 3.11 cho thấy các loại dịch chiết phôi hạt Na đã đƣợc làm ẩm bằng NaOH 5% tuy có cùng nồng độ 10% song do thời gian ngâm chiết khác nhau nên lƣợng hoạt chất đƣợc tiết ra từ dƣợc liệu sẽ khác nhau và độc tính đối với ve chó thí nghiệm cũng khác nhau.
Dịch chiết phôi hạt Na đã đƣợc làm ẩm bằng NaOH 5% sau khi ngâm 36 giờ có độc tính cao nhất, thời gian gây chết ve chó thí nghiệm là ngắn nhất. Nếu chỉ ngâm 12; 24 giờ thì độc tính chƣa đủ mạnh, còn nếu ngâm quá 36 giờ thì độc tính giảm dần theo thời gian ngâm chiết.
Kết quả thí nghiệm cụ thể nhƣ sau:
Khi ve chó tiếp xúc với dịch chiết có thời gian ngâm chiết 12; 24 giờ sau 78 và 72 phút có 50% số ve chó bị chết. Thời gian gây chết 50% số ve chó thí nghiệm sau khi tiếp xúc với dịch chiết có thời gian ngâm chiết 36; 48 và 60 giờ lần lƣợt là 65; 75 và 90 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thời gian diệt 100% số ve chó thí nghiệm sau khi tiếp xúc với dịch chiết có thời gian ngâm chiết 12 và 24 giờ là 130 và 126 phút. Khi ngâm dịch chiết với thời gian 36 giờ thì mất 120 phút để diệt 100% số ve chó thí nghiệm. Còn khi ngâm kéo dài rồi chiết ở 48 và 60 giờ thì độc lực của dịch chiết bị giảm đi nên thời gian gây chết 100% số ve chó thí nghiệm đã tăng lên, lần lƣợt là: 135 và 160 phút. Trong khi đó toàn bộ ve chó thí nghiệm ở lô đối chứng (sử dụng dung dịch NaOH có nồng độ tƣơng đƣơng nồng độ NaOH làm dung môi để thu dịch chiết sử dụng trong thí nghiệm) vẫn bình thƣờng.
Kết quả kiểm tra độc tính các loại dịch chiết phôi hạt Na 10% đƣợc làm ẩm bằng NaOH 5% có thời gian ngâm chiết khác nhau đƣợc minh họa bằng hình 3.3.
Hình 3.3. Biểu đồ kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết phôi hạt Na 10% trong môi trường NaOH 5% tại các thời điểm chiết xuất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Qua hình trên thấy: Sử dụng dịch chiết phôi hạt Na có thời gian ngâm chiết trong 36 giờ là tốt nhất, nếu ngâm ít hơn hoặc nhiều hơn thời gian này độc tính của dịch chiết giảm (thể hiện ở thời gian gây chết ve chó thí nghiệm tăng lên) dẫn đến giảm hiệu quả sử dụng. Hạt Na khi ngâm chƣa đủ thời gian thì lƣợng hoạt chất đƣợc giải phóng ra chƣa nhiều còn nếu ngâm lâu thì các thành phần hữu cơ sẽ bị phân hủy, trong đó số lƣợng và chất lƣợng hoạt chất đã bị giảm vì vậy độc tính của dịch chiết cũng giảm khi thời gian ngâm chiết kéo dài.
b) Xác định thời gian ngâm chiết thích hợp của dịch chiết hạt Củ đậu đã được làm ẩm trong môi trường NaOH 5%.
Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết hạt Củ đậu 5% trong môi trường NaOH 5% tại các thời điểm chiết xuất
Thời gian chiết xuất (giờ)
Thời gian gây chết 50% số ve thí nghiệm (phút)
Thời gian gây chết 100% số ve thí nghiệm (phút) 12 32 43 24 25 35 36 35 45 48 50 60 60 54 68
Đối chứng Ve thí nghiệm không chết trong suốt thời gian thí nghiệm Kết quả bảng 3.12 cho thấy: Dịch chiết hạt Củ đậu 5% ngâm trong cùng môi trƣờng NaOH 5% nhƣng thu tại các thời điểm khác nhau đã có độc tính khác nhau đối với ve chó thí nghiệm (Đánh giá bằng thời gian 50% và 100% ve chó thí nghiệm bị chết bởi dịch chiết hạt Củ đậu).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đánh giá chung thấy: Dịch chiết hạt Củ đậu trong môi trƣờng NaOH 5% chiết tại thời gian ngâm 24 giờ có độc tính cao nhất. Thời gian chết của ve chó thí nghiệm là ngắn nhất. Độc tính dịch chiết chƣa đủ mạnh ở thời gian ngâm 12 giờ, giảm dần ở thời gian ngâm 36, 48 và 60 giờ. Tức thời gian chết của các ve chó thí nghiệm kéo dài thêm nếu thời gian ngâm càng lâu.
Ve chó có độ mẫn cảm rất cao với dịch chiết hạt Củ đậu trong môi trƣờng NaOH 5%, vì thời gian giết chết ve chó thí nghiệm rất ngắn: ở thời điểm thu 24 giờ sau khi ngâm đã diệt 100% ve chó sau 35 phút tiếp xúc với dịch thuốc. Độc tính dịch chiết giảm dần nếu thời gian chiết xuất tăng lên. Điều đó chứng tỏ hoạt chất bị phá huỷ dần khi ngâm quá lâu.
Kết quả kiểm tra độc tính của phôi hạt Củ đậu 5% trong môi trƣờng NaOH 5% đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Biểu đồ kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết hạt Củ đậu 5% trong môi trường NaOH 5% tại các thời điểm chiết xuất
Qua hình trên cho thấy, dịch chiết hạt Củ đậu 5% trong môi trƣờng NaOH 5% tốt nhất nên thu sau khi ngâm 24 giờ. Ngoài thời gian trên độc tính của dịch chiết đối với ve chó thí nghiệm bị giảm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tóm lại qua kết quả của thí nghiệm trên đã xác định đƣợc thời gian và môi trƣờng chiết xuất thích hợp đối với từng loại dƣợc liệu. Để định hƣớng cho việc sử dụng các dƣợc liệu này trong tƣơng lai, cũng nhƣ việc xác định liều lƣợng làm cơ sở cho điều trị thử nghiệm trên chó nuôi, tiếp tục làm thí nghiệm thử độc tính dịch chiết của các dƣợc liệu trên các dải nồng độ khác nhau.
3.3.1.3. Thí nghiệm kiểm tra độc tính của dịch chiết phôi hạt Na và hạt cây Củ đậu với các nồng độ khác nhau trong môi trường và thời gian ngâm chiết thích hợp
a) Kết quả kiểm tra độc tính của dịch chiết phôi hạt Na với các nồng độ khác nhau sau 36 giờ trong môi trường NaOH 5% đối với ve chó thí nghiệm
Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra độc tính dịch chiết phôi hạt Na với các nồng độ khác nhau được làm ẩm bằng NaOH 5%, thời gian ngâm chiết 36 giờ
Nồng độ dịch chiết (%)
Thời gian gây chết 50% số ve thí nghiệm (phút)
Thời gian gây chết 100% số ve thí nghiệm (phút) 5 - - 10 65 120 20 40 90 30 32 84 50 18 70
Đối chứng Ve thí nghiệm không chết trong suốt thời gian thí nghiệm Từ kết quả bảng 3.13 nhận thấy: nồng độ dịch thuốc càng cao thời gian giết chết ve chó thí nghiệm càng ngắn. Mức độ mẫn cảm của ve chó thí nghiệm đối với các nồng độ dịch thuốc là khác nhau.
Kết quả cụ thể nhƣ sau:
Ở nồng độ 50 % thời gian để diệt 100% ve chó mất 70 phút. Ở nồng độ 30 % diệt 100% ve chó cần 84 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ở nồng độ 20 % diệt 100% ve chó cần 90 phút. Ở nồng độ 10 % diệt ve chó 100% mất 120 phút.
Nhƣng ở nồng độ 5% sau 360 phút làm thí nghiệm chỉ diệt đƣợc 40 % ve chó. Dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau có độc tính khác nhau đối với ve chó thí nghiệm. Nồng độ càng cao độc tính của dịch chiết càng cao, biểu hiện thời gian chết của ve chó thí nghiệm càng rút ngắn xuống.Với nồng độ dịch chiết phôi hạt Na trên 10% đều có tác dụng diệt 100% ve chó trong khoảng từ 70 - 120 phút.
Nhƣ vậy để sử dụng hạt Na nên dùng nồng độ trên 5%. Kết quả ở bảng 3.13 đƣợc minh họa ở hình 3.5.