4. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu
Việc thu thập mẫu đƣợc tiến hành ngẫu nhiên với các hộ gia đình chăn nuôi chó. Số chó lấy mẫu phân bố ở hai huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên: huyện Phổ Yên và thị xã Sông Công.
- Mẫu ve: Tiến hành bắt hết ve ở 4 chân, 2 tai, vùng cổ, đầu và ở thân chó (thực hiện đối với những con chó nuôi thuần, hƣớng dẫn cho chủ nhà thực hiện việc bắt ve). Thu thập tất cả số ve trên mỗi chó vào một bình tam giác, ghi nhãn đầy đủ, để nơi thoáng mát và nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm.
- Mẫu máu: Cố định chó, lấy mẫu máu chó khoẻ không bị nhiễm ve và máu chó bị ve ký sinh với cƣờng độ nhiễm nặng, có biểu hiện lâm sàng rõ rệt tại tĩnh mạch khoeo chân sau (1ml/chó) đựng trong ống nghiệm có chất chống đông máu Natricitrat.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.2. Phƣơng pháp xác định tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve
- Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm ve:
Tiến hành bắt ve trên từng chó, nếu tìm thấy ve thì xác định là có nhiễm, ngƣợc lại là không nhiễm.
- Phương pháp xác định cường độ nhiễm ve:
Cƣờng độ nhiễm ve của mỗi chó đƣợc quy định bằng số lƣợng ve thu thập đƣợc theo phƣơng pháp thu thập mẫu ve ở trên (đơn vị tính: số ve/chó).
2.3.3. Quy định một số yếu tố liên quan đến các chỉ tiêu nghiên cứu dịch tễ bệnh ve ở chó tễ bệnh ve ở chó
- Lứa tuổi chó:
Tuổi chó đƣợc phân ra theo 3 lứa tuổi: < 3 tháng tuổi (chó theo mẹ);
≥ 3 - 12 tháng tuổi (chó đã cai sữa, đƣợc nuôi trong môi trƣờng mới); ≥ 12 tháng tuổi (chó trƣởng thành).
- Mùa vụ trong năm:
Theo dõi tình trạng nhiễm ve ở 2 mùa: + Mùa khô: từ tháng 10 - tháng 3 năm sau. + Mùa mƣa: từ tháng 4 - tháng 9.
2.3.4. Phƣơng pháp theo dõi các biểu hiện lâm sàng chủ yếu của chó bị ve ký sinh ký sinh
Trực tiếp quan sát trạng thái cơ thể và các biểu hiện không bình thƣờng của những chó bị nhiễm ve, kết hợp hỏi chủ nuôi một số thông tin cần thiết, từ đó xác định đƣợc các biểu hiện lâm sàng chủ yếu của chó bị ve ký sinh.
2.3.5. Xét nghiệm máu (để xác định sự thay đổi một số chỉ số máu của chó bị ve ký sinh) bị ve ký sinh)
Dùng máy Osmetech OPTI - CCA/ Blood GasAnalfzen tại bệnh viện Đa khoa Trung Ƣơng tỉnh Thái Nguyên để xác định một số chỉ số máu của chó bị
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
ve ký sinh và chó khỏe: Số lƣợng hồng cầu, số lƣợng bạch cầu, công thức bạch cầu và hàm lƣợng huyết sắc tố.
2.3.6. Phƣơng pháp thử nghiệm chiết xuất hoạt chất từ hạt Na và hạt cây Củ đậu để trị ve cho chó Củ đậu để trị ve cho chó
Sơ đồ thử nghiệm chiết xuất hoạt chất từ hạt Na và hạt cây Củ đậu:
Dƣợc liệu
Dƣợc liệu đƣợc làm ẩm bằng 10 ml một trong các dung dịch sau:
NaOH 5% HCl 5% Cồn 400 Nƣớc cất
Ngâm chiết dƣợc liệu
Kiểm tra độc tính dịch chiết sau 24 giờ với ve thí nghiệm
Xác định môi trƣờng chiết xuất tốt nhất
Kiểm tra độc tính dịch chiết với thời gian ngâm khác nhau (giờ)
12 24 36 48 60
Xác định thời gian ngâm chiết thích hợp
Kiểm tra độc tính dịch chiết ở các nồng độ
Xđ LD50, LD100 với ve chó
Điều trị thử nghiệm trên chó
Sơ đồ bố trí thí nghiệm dựa theo quy trình “Sơ bộ xác định thành phần một dƣợc liệu” của Đỗ Tất Lợi và Ngô Xuân Thu (1970) [18] và phƣơng pháp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
chiết xuất ancaloid của Stas - Otto (Hà Nhƣ Phú, 1973) [24].
- Tách hoạt chất trong dƣợc liệu từ dạng liên kết sang dạng tự do:
Tẩm ƣớt dƣợc liệu bằng 10ml các dung dịch NaOH 5%, HCl 5%, cồn 400, nƣớc cất. Để 1 giờ. Mục đích là chuyển các hoạt chất trong dƣợc liệu từ dạng liên kết sang dạng tự do để các hoạt chất này có thể hoà tan vào dung môi chiết xuất. Cho thêm 90 ml nƣớc cất vào ngâm tiếp, lúc này các hoạt chất trong dƣợc liệu đƣợc hòa tan vào dịch chiết. Lọc kiệt, bỏ bã thu dịch chiết.
- Thử độc tính dịch chiết dƣợc liệu trên ve chó thí nghiệm theo phƣơng pháp "Dƣợc lý thực nghiệm" đã viết trong "Từ điển bách khoa dƣợc học" Nguyễn Duy Cƣơng, Nguyễn Hữu Quỳnh (1999) [5] và theo tài liệu của Nguyễn Nhƣ Viên (1975) [35].
Dịch chiết thu đƣợc đem pha loãng ở các nồng độ khác nhau để kiểm tra độc tính với ve chó thí nghiệm. Ở các môi trƣờng chiết xuất khác nhau, lƣợng hoạt chất thu đƣợc trong dịch chiết cũng khác nhau. Bằng cách theo dõi thời gian chết 50% và 100% ve chó thí nghiệm sẽ đánh giá đƣợc độc tính của dịch chiết: thời gian chết càng ngắn thì độc tính càng cao. Qua đó chúng ta sẽ xác định đƣợc môi trƣờng ngâm chiết tốt nhất với từng loại dƣợc liệu.
Cùng một môi trƣờng ngâm chiết nhƣng thời gian ngâm khác nhau, lƣợng hoạt chất thu đƣợc ở dịch chiết cũng khác nhau. Do vậy chúng tôi tiếp tục sử dụng các dịch chiết có khoảng thời gian ngâm khác nhau: 12, 24, 36, 48 và 60 giờ để kiểm tra độc tính trên ve chó thí nghiệm. Kết quả sẽ tìm đƣợc thời gian ngâm chiết thích hợp với từng loại dƣợc liệu.
Tiếp tục sử dụng dịch chiết trong các môi trƣờng và thời gian ngâm thích hợp pha loãng ở các nồng độ khác nhau để kiểm tra độc tính dịch chiết với ve chó thí nghiệm. Từ đó xác định đƣợc nồng độ tác dụng thích hợp của dịch chiết dƣợc liệu với ve chó. Xác định LD50 và LD100 với ve chó để làm cơ sở cho việc điều trị thử nghiệm khẳng định hiệu lực điều trị của dƣợc liệu đối với ve ký sinh trên chó.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.7. Chuẩn bị dƣợc liệu
2.3.7.1. Dịch chiết phôi hạt Na
Hạt Na phơi khô bóc bỏ lớp vỏ đen cứng, chỉ lấy phôi.
- Dịch chiết phôi hạt Na trong các môi trƣờng: Phôi hạt Na nghiền nhỏ tẩm ƣớt bằng một trong các dung dịch NaOH 5%, HCl 5%, cồn 400
theo tỷ lệ 100 gr phôi nghiền nhỏ với 10 ml dung môi, cho vào bình tam giác, để 1 giờ. Sau đó đổ nƣớc vào ngâm tiếp 11, 23, 35, 47 hoặc 59 giờ tùy từng thí nghiệm. Lọc, thu dịch chiết, cho thêm nƣớc cất vào bã, lắc, lọc kiệt và chắt sao cho tổng dịch chiết thu đƣợc vừa đủ 100 ml. Dịch chiết này đƣợc quy ƣớc có nồng độ 100%, pha loãng ở các nồng độ khác nhau để làm thí nghiệm.
- Nƣớc ngâm phôi hạt Na: Cân 100 gr phôi hạt Na cho vào bình tam giác, làm ƣớt bằng 10 ml nƣớc cất, sau đó 1 giờ cho thêm 90 ml nƣớc cất, thời gian ngâm tiếp theo tùy thí nghiệm. Lọc, chắt kiệt, thu dịch chiết, cho thêm nƣớc cất vào bã, lắc, lọc kiệt và chắt sao cho tổng dịch chiết thu đƣợc vừa đủ 100 ml. Dịch chiết này có nồng độ quy ƣớc 100%, pha loãng ở các nồng độ khác nhau để làm thí nghiệm.
2.3.7.2. Dịch chiết hạt Củ đậu
Quả Củ đậu chín hái về phơi khô, thu hạt nghiền nhỏ.
- Dịch chiết hạt Củ đậu đã đƣợc làm ẩm bằng một trong các môi trƣờng NaOH 5%, HCl 5%, cồn 400 : cân 10 gr bột hạt Củ đậu cho vào bình tam giác, làm ẩm bằng 10 ml dung môi để 1 giờ. Sau đó cho thêm 90 ml nƣớc cất vào ngâm tiếp 11, 23, 35, 47 hoặc 59 giờ tùy từng thí nghiệm. Lọc, thu dịch chiết, cho thêm nƣớc cất vào bã, lắc, lọc kiệt rồi chắt sao cho tổng lƣợng dịch chiết thu đƣợc vừa đủ 100 ml. Dịch chiết này đƣợc quy ƣớc có nồng độ 10%, pha loãng ở các nồng độ khác nhau làm thí nghiệm.
- Nƣớc ngâm hạt Củ đậu: Cân 10 gr bột hạt Củ đậu cho vào bình tam giác làm ẩm bằng 10 ml nƣớc cất, sau đó 1 giờ cho thêm 90 ml nƣớc cất, thời
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
gian ngâm tiếp theo tùy thí nghiệm. Lọc, chắt kiệt, nếu chƣa đủ 100 ml dịch chiết lại cho thêm nƣớc cất vào bã, lắc, lọc kiệt, chắt vừa đủ 100 ml. Dịch chiết này có nồng độ quy ƣớc 10% pha loãng ở các nồng độ để làm thí nghiệm.
2.3.8. Chuẩn bị động vật thí nghiệm
+ Ve chó thí nghiệm: Ve chó đƣợc bắt ở những chó nhiễm ve tại các hộ dân thuộc huyện Phổ Yên và thị xã Sông Công, tỉnh Thái Nguyên. Chọn những con ve có kích thƣớc tƣơng đƣơng để làm thí nghiệm.
+ Chó thí nghiệm:
- Thử trên diện hẹp: 12 con chó bị nhiễm ve với cƣờng độ nặng và có biểu hiện lâm sàng rõ đƣợc nuôi trong các hộ gia đình thuộc huyện Phổ Yên và thị xã Sông Công.
- Tiến hành trên diện rộng: 269 chó nhiễm ve (có biểu hiện lâm sàng rõ) tại các hộ dân thuộc huyện Phổ Yên và thị xã Sông Công, tỉnh Thái Nguyên.
2.3.9. Bố trí và tiến hành thí nghiệm
2.3.9.1. Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh ve chó ở hai huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên
+ Nghiên cứu tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve ở chó tại một số xã, phƣờng của huyện Phổ Yên và thị xã Sông Công
Tại mỗi huyện, thị chúng tôi tiến hành điều tra tại 4 xã, phƣờng có điều kiện tự nhiên, kinh tế và xã hội khác nhau. Tổng số chó điều tra 256 con chó:
- Tại huyện Phổ Yên, điều tra 224 chó tại xã Thành Công (58 chó), Thuận Thành (49 chó), Phúc Thuận (40 chó) và thị trấn Ba Hàng (56 chó).
- Tại thị xã Sông Công, điều tra 165 chó tại phƣờng Mỏ Chè (49 chó), Bình Sơn (41 chó), Tân Quang (38 chó) và Phố Cò (37 chó).
Tại mỗi xã, phƣờng, xác định tỷ lệ nhiễm ve trung bình, cƣờng độ nhiễm ve min - max ở chó, tính tỷ lệ nhiễm ve trung bình và cƣờng độ nhiễm ve min
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
- max của từng huyện thị để so sánh sự sai khác nhau và tính chung cho cả 2 huyện, thị.
+ Nghiên cứu tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve theo tuổi chó
Chúng tôi tiến hành điều tra 226 con chó, trong đó: chó dƣới 3 tháng tuổi là 48 con, chó từ 3 tháng tuổi đến 1 năm tuổi là 73 con và chó trên 1 năm tuổi là 105 con. Tất cả 226 con chó đƣợc điều tra đều có chung đặc điểm:
- Phƣơng thức nuôi và điều kiện vệ sinh thú y tƣơng đối giống nhau; - Tính biệt đực;
- Giống chó nội;
- Thời gian điều tra từ tháng 4/2011 - 5/2011.
Xác định tỷ lệ nhiễm ve trung bình, cƣờng độ nhiễm ve min - max ở từng độ tuổi chó để so sánh sự sai khác nhau và tính chung cho tất cả các lứa tuổi chó.
+ Nghiên cứu tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve theo tính biệt chó
Điều tra 199 chó: 105 chó đực (Phổ Yên: 58con, Sông Công: 47 con) và 94 chó cái (Phổ Yên: 51 con, Sông Công: 43 con). Tất cả 199 con chó đƣợc điều tra đều có chung đặc điểm:
- Phƣơng thức nuôi và điều kiện vệ sinh thú y tƣơng đối giống nhau; - Lứa tuổi: từ 1 năm tuổi trở lên;
- Giống chó nội;
- Thời gian điều tra từ tháng 4/2011 - 5/2011.
Tính tỷ lệ nhiễm ve trung bình, cƣờng độ nhiễm ve min - max ở chó đực và chó cái để so sánh sự sai khác nhau về tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve theo tính biệt chó.
+ Nghiên cứu tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve theo giống chó
Điều tra 246 chó: 141 chó lai (Phổ Yên: 63 con, Sông Công: 78 con) và 105 chó nội (Phổ Yên: 58con, Sông Công: 47 con). Tất cả 246 con chó đƣợc điều tra đều có chung đặc điểm:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Phƣơng thức nuôi và điều kiện vệ sinh thú y tƣơng đối giống nhau; - Lứa tuổi: từ 1 năm tuổi trở lên;
- Tính biệt đực;
- Thời gian điều tra từ tháng 4/2011 - 5/2011.
Tính tỷ lệ nhiễm ve trung bình, cƣờng độ nhiễm ve min - max ở chó lai và chó nội để so sánh sự sai khác nhau về tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve theo giống chó.
+ Nghiên cứu tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve ở chó theo mùa
Điều tra tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve của chó ở 2 mùa: mùa mƣa (254 chó, đƣợc điều tra từ tháng 4 - 9/2011) và mùa khô (208 chó, đƣợc điều tra từ tháng 10/2010 - 3/2011). Tất cả 462 con chó đƣợc điều tra đều có chung đặc điểm:
- Phƣơng thức nuôi và điều kiện vệ sinh thú y tƣơng đối giống nhau; - Lứa tuổi: từ 1 năm tuổi trở lên;
- Tính biệt đực; - Giống chó nội.
Tính tỷ lệ nhiễm ve trung bình, cƣờng độ nhiễm ve min - max ở chó trong mùa mƣa và mùa khô để so sánh sự sai khác nhau về tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ve ở chó theo mùa trong năm.
2.3.9.2. Nghiên cứu về lâm sàng bệnh ve ở chó
+ Những biểu hiện lâm sàng chủ yếu của chó bị ve ký sinh
Theo dõi 80 chó bị nhiễm ve ở cƣờng độ nặng, nhẹ khác nhau. Số chó này đƣợc lấy ở 8 xã, phƣờng đƣợc điều tra dịch tễ bệnh ve chó thuộc 2 huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên (mỗi xã, phƣờng lấy 10 chó). Tất cả 80 chó có chung đặc điểm:
- Chỉ bị nhiễm ve và không mắc bệnh nào khác; - Lứa tuổi: từ 1 năm tuổi trở lên;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
Xác định số chó có biểu hiện lâm sàng, tính tỷ lệ chó có biểu hiện lâm sàng và các biểu hiện lâm sàng thƣờng thấy nhƣ: kém ăn, thiếu máu, niêm mạc nhợt nhạt, cơ thể gầy yếu, da lông xù xì, dày lên, có biểu hiện bị kích thích, khó chịu , thƣờng xuyên gãi, gậm, liếm những chỗ bị ve ký sinh.
+ So sánh sự thay đổi một số chỉ số máu và công thức bạch cầu của chó bị ve ký sinh với chó khỏe
- Xét nghiệm máu của chó bị ve ký sinh (15 mẫu) và máu của chó không bị ve ký sinh (15 mẫu).
- Xác định chỉ số máu và công thức bạch cầu của chó bị ve ký sinh và chó khỏe tại bênh viện Đa khoa Trung Ƣơng tỉnh Thái Nguyên.
So sánh sự sai khác về một số chỉ tiêu huyết học và công thức bạch cầu của chó bị ve ký sinh và chó khỏe.
2.3.9.3. Chế và thử nghiệm chiết xuất từ hạt Na và hạt cây Củ đậu trong phòng thí nghiệm
Bắt ve chó thả vào hộp lồng, mỗi hộp thả 10 con có kích thƣớc tƣơng đối đồng đều, khỏe. Hút dịch thuốc vào hộp lồng để nhúng ƣớt hết mình ve, sau đó cho ve sang hộp lồng khô để theo dõi.
Tất cả các thí nghiệm đều có bố trí lô đối chứng.
- Theo dõi các biểu hiện của ve chó thí nghiệm sau khi tiếp xúc với dịch thuốc. - Theo dõi thời gian chết 50% và 100% ve chó thí nghiệm.
- Thời gian theo dõi thí nghiệm liên tục trong 6 giờ.
a) Thí nghiệm xác định môi trƣờng chiết xuất thích hợp cho từng loại dƣợc liệu.
+ Kiểm tra độc tính của dịch chiết phôi hạt Na sau 24 giờ trong các môi trƣờng chiết xuất khác nhau
Dùng phôi của hạt Na nghiền thành bột ngâm trong 4 loại môi trƣờng: NaOH 5%, HCl 5%, cồn 400
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
loại dịch chiết. Các dịch chiết thu đƣợc đem pha loãng ở nồng độ 10% thử với ve chó. Bố trí 4 lô đối chứng tƣơng ứng sử dụng nƣớc cất và dung dịch có độ pH, độ cồn tƣơng đƣơng độ pH, độ cồn của các dung dịch dùng trong thí nghiệm. Theo dõi thời gian gây chết ve chó của từng loại môi trƣờng, kết luận môi trƣờng thích hợp nhất để chiết phôi hạt Na (dựa vào thời gian gây chết 50% và 100% ve chó thí nghiệm là ngắn nhất)