Kết quả & Thảo luận
3.2.3. Sâm Ngọc Linh
Sau 30 ngày nuôi cấy, các mẫu ñều phát sinh mô callus. Mẫu cấy lá và
ñoạn cuống cắt ngang có khả năng phát sinh callus tốt hơn ñoạn cuống cắt dọc. Callus ñạt ñược có khả năng tái sinh cao rất phù hợp cho các quá trình nuôi cấy tiếp theo.
Bảng 5. Ảnh hưởng của cách lấy mẫu từ lá và cuống lá ñến sự phát sinh mô sẹo cây Sâm Ngọc Linh
Môi trường Loại mẫu cấy Trban ọng lượng mẫu
ñầu (mg)*
Trọng lượng mẫu sau khi nuôi cấy (mg)* 0,8 10 25 1,0 17 44 TN2 1,2 31 95 tTCL 2 7 lTCL 40 75
Ghi chú: * trọng lượng trung bình của 2 mẫu
Callus là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ
quan ñã phân hoá dưới các ñiều kiện ñặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất
ñiều hoà sinh trưởng thực vật …). Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải trải qua sự phản phân hoá trước lần phân chia ñầu tiên. Sự phản phân hoá cho phép một tế bào ñã trưởng thành trở lại trạng thái “trẻ hoá”, giúp tế bào tái lập khả năng phân chia trong các ñiều kiện thích hợp. Các yếu tốảnh hưởng ñến quá trình phát sinh callus gồm có cơ quan, tuổi cơ quan, phương pháp cắt mẫu, ánh sáng, nồng ñộ và loại các chất ñiều hoà sinh trưởng thực vật (Lượng và Tiên, 2006).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Trọng lượng mẫu ban ñầu (mg)* Trọng lượng mẫu
sau khi nuôi cấy
(mg)* 0,8 1,0 1,2 tTCL lTCL
ðồ thị 3. Ảnh hưởng của cách lấy mẫu từ lá và cuống lá ñến sự phát sinh mô sẹo cây Sâm Ngọc Linh
Lá và cuống lá là một trong những cơ quan thường ñược sử dụng làm vật liệu tạo callus. Nguyên nhân là do cấu trúc ñặc trưng của chúng. Nhu mô thịt lá, phần chủ yếu của phiến lá, có vách sơ cấp mỏng còn tiềm năng phân chia tế bào. Nhờ tiềm năng này, các tế bào nhu mô có vai trò hàn gắn vết thương và thường
ñược dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. Cuống lá là mẫu chứa các mô phân sinh lóng, có nguồn gốc từ mô phân sinh ngọn, nhưng ở xa mô phân sinh ngọn, xen kẽ giữa những vùng mô ñã ít nhiều phân hoá (Việt, 2002). Các tế
bào nhu mô của mộc và libe, các tế bào tiết và các tế bào nhu mô tuỷ là những tế
bào có khả năng tạo callus cao (Lượng và Tiên, 2006).
Việc sử dụng lá và cuống lá làm nguồn nguyên liệu ban ñầu cho quá trình phát sinh callus, cũng ñồng thời là nguồn nguyên liệu cho các quá trình biệt hoá sau này có một số ưu ñiểm so với việc sử dụng rễ củ Sâm. Thứ nhất, rễ củ Sâm phải ñạt ñộ tuổi phù hợp mới có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban ñầu. ðối với Sâm Ngọc Linh, theo khảo sát của Trung tâm Sâm, mẫu cấy lấy từ rễ cây 2 – 4 tuổi phát triển nhanh và tốt hơn. Củ Sâm 2 – 3 tuổi có trọng
ñầu sẽ bị hạn chế. Nếu sử dụng nguồn nguyên liệu là lá sẽ chủ ñộng hơn và nguồn mẫu ban ñầu cũng nhiều hơn. Thứ hai, rễ củ Sâm có hệ thống mạch và bó mạch lớn và nhiều, lại thu nhận từ dưới ñất nên các yếu tố tạp nhiễm là
ñiều không tránh khỏi. Mẫu sẽ dễ bị nhiễm do việc vô trùng chỉ xảy ra trên bề
mặt, không thể loại bỏ triệt ñể các yếu tố gây nhiễm, ñặc biệt khi chúng nằm bên trong rễ, ở vị trí các bó mạch. Mặt khác, nếu khử trùng quá lâu sẽ làm ảnh hưởng ñến chất lượng mẫu, làm mất khả năng tái sinh callus (Teng và cộng sự, 2002). Mẫu lá tuy cũng tập trung nhiều hệ thống mạch, nhưng nhỏ hơn, lại ở
trên mặt ñất nên khử trùng dễ hơn và tỷ lệ nhiễm ít hơn. Ngoài ra, callus từ lá cũng có khả năng biệt hoá tạo chồi và rễ bất ñịnh (Nhut và cộng sự, 2006). Do
ñó, lá và cuống lá là nguồn nguyên liệu phù hợp cho quá trình khởi tạo callus Sâm Ngọc Linh. Tuy nhiên, những nghiên cứu cụ thể cần ñược thực hiện ñể
có những so sánh chính xác trên nguồn nguyên liệu ban ñầu là rễ củ và lá. Nghiên cứu của Trung tâm Sâm từ năm 1984 ñã khảo sát ảnh hưởng của sự hình thành và tăng trưởng callus từ các bộ phận khác nhau của loài Sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu cho thấy mẫu lá có gân chính hình thành callus trong 3 – 4 tuần với tỷ lệ 100%, rễ hình thành trong 1 – 2 tuần với tỷ lệ 96,66%, còn thân phát sinh trong 4 tuần với tỷ lệ 100% và chỉ có 20% hạt hình thành callus trong vòng 12 tuần (Dong và cộng sự, 2007). Trên cùng ñối tượng, Phong (2006) cũng khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy (lá, cuống lá và chồi hoa) lên sự phát sinh callus với kết quả là callus tạo ñược tốt nhất ở lá và cuống lá với tỷ lệ lần lượt là 77,8% và 57,1%. Khi tiến hành khảo sát khả năng tạo callus ban
ñầu trên lá và cuống lá Sâm Ngọc Linh, chúng tôi nhận thấy dưới ảnh hưởng của auxin và cytokinin, lá và cuống lá Sâm Ngọc Linh tạo ñược callus với tỷ
lệ cao, lên ñến 1 0 0 % . Callus màu vàng nhạt, dạng cứng chắc (Hình 8). ðây là dạng callus có khả năng tái sinh cao, phù hợp cho các quá trình biệt hoá sau này.
Kích thước mẫu cấy là một yếu tố quan trọng trong nhân giống in vitro. Nó
ảnh hưởng trực tiếp ñến sự tăng trưởng của tế bào và quá trình chuyển hoá các chất trong nuôi cấy tế bào thực vật (Akalezi, 1999). Nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ñã ñược tiến hành cho thấy kích thước ảnh hưởng
ñến nhiều yếu tố như tỷ lệ sống sót, khả năng tạo rễ, phát sinh callus, phát sinh chồi… Nghiên cứu về ảnh hưởng của kích thước lên khả năng tạo chồi từ phôi hữu tính của Espinass và cộng sự (1989) cho thấy kích thước 0,4 ñến 1,2 mm của phôi hữu tính ở giai ñoạn hình tim phát sinh callus tốt nhất và cho nhiều chồi nhất. Micheal và cộng sự (1991) tiến hành khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu lá Petunia lên khả năng tạo chồi với các kích thước 13, 10, 8, 5 và 3 mm ñường kính; 10 mm ñường kính với lỗ 5 hoặc 3 mm ở giữa và 13 mm ñường kính với lỗ 8 hoặc 5 mm ở giữa. Kết quả cho thấy lượng chồi nhiều nhất tập trung ở các mẫu có kích thước 13 mm và 13 mm với lỗ 5 mm ở giữa cho thấy có sự tương quan là kích thước lớn nhất sẽ cho nhiều chồi nhất (Micheal và cộng sự, 1991). Theo Akalezi (1999), sự chênh lệch trong kích thước mẫu cấy ban ñầu sẽ dẫn ñến sự khác biệt lớn về mật ñộ tế bào trong quá trình nuôi cấy và một loạt các thông số của môi trường sẽ bị biến ñổi. Một cách trực tiếp hay gián tiếp thì những thay ñổi này sẽảnh hưởng ñến các quá trình chuyển hoá trong tế bào. Tác giả cũng ñưa ra giả thuyết rằng cơ cấu tổ chức giữa các tế bào do kích thước ban
ñầu quy ñịnh và các thành phần ñược giải phóng khỏi tế bào trong quá trình nuôi cấy sẽ là những nhân tốt quyết ñịnh ñến chất lượng của quá trình nuôi cấy in vitro (Akalezi và cộng sự, 1999). Trong thí nghiệm này chúng tôi thu ñược callus lớn nhất trên mẫu lá có ñường kính 1,2 cm, kết quả này tương tự như kết quả mà Micheal và cộng sự (1991) ñã ñạt ñược. Kích thước của mẫu cấy có liên quan
ñến diện tích tiếp xúc môi trường, lá có ñường kính 1,2 cm có bề mặt lớn nên khả
năng hấp thu nguồn dinh dưỡng tốt hơn các mẫu khác. ðặc biệt khi quan sát các vị trí hình thành callus chúng tôi nhận thấy callus hình thành từ mép lá vào trong và những callus hình thành ñầu tiên tại vị trí vết cắt. Chứng tỏ vết thương ñóng
năng hình thành callus càng mạnh (ðồ thị 3, Hình 8).
Khi so sánh khối lượng ban ñầu của mẫu cấy và sau khi nuôi cấy chúng tôi nhận thấy rằng mẫu lTCL tăng 1,87 lần, mẫu cấy tTCL tăng 3,5 lần, mẫu cấy lá có ñường kính 0,8 cm tăng 2,5 lần, mẫu cấy lá có ñường kính 1,0 cm tăng 2,6 lần và mẫu cấy lá có ñường kính 1,2 cm tăng 3,1 lần. Mẫu cấy thân cắt ngang và lá có khả năng tái sinh mạnh hơn thân cắt dọc (Bảng 5). Tuy mẫu lá khả năng tái sinh không mạnh bằng thân cắt ngang nhưng nguồn mẫu nhiều và dễ chủ ñộng khi lấy mẫu, khối lượng mô sẹo thu ñược lớn trong thời gian ngắn.
Các mẫu cấy tTCL có lớp tế bào tiết và các nhu mô tủy là những tế bào có khả năng tạo callus rất cao (Lượng và Tiên, 2006), khi cắt mẫu các tế bào này
ñược tiếp xúc trực tiếp với môi trường (mẫu ñặt vuông góc với môi trường cấy) rất thuận lợi cho quá trình hấp thu dinh dưỡng và chất ñiều hòa sinh trưởng nên khả năng phát sinh mô sẹo diễn ra nhanh.
Hình 8. Ảnh hưởng cách lấy mẫu từ lá và cuống lá cây Sâm Ngọc Linh ñến khả
năng phát sinh mô sẹo
a, a1: lTCL; b, b1: tTCL; c, c1: mẫu cấy lá ñường kính 0,8 cm; d, d1: mẫu cấy lá ñường kính 1,0 cm; e, e1: mẫu cấy lá ñường kính 1,2 cm; f, g: so sánh mẫu lá và thân