Sự khác biệt chủ yếu của phương pháp nhân giống sử dụng các kỹ thuật nuụi cấy mụ so với cỏc phương phỏp truyền thống ủó ủược ủề cập rất nhiều trong các tài liệu khoa học. ðiều kiện tiên quyết dẫn tới sự thành công của phương phỏp này là ủảm bảo yếu tố vụ trựng trong hầu hết cỏc khõu của quỏ trỡnh nuụi cấy, từ giai ủoạn vụ mẫu ủến giai ủoạn vườn ươm. Tuy nhiờn ủa số cỏc mẫu cấy cú nguồn gốc ex vitro tỏch từ cõy mẹ ngoài ủồng lại chứa lượng lớn vi sinh gõy bệnh tạo ra nhiều bất lợi cho quỏ trỡnh nuụi cấy. Chọn mụ sạch bệnh từ cõy mẹ ủể nuụi cấy là việc hết sức quan trọng, quyết ủịnh hiệu quả của quỏ trỡnh nuụi cấy.
Việc khử trùng các mô thực vật trước khi cấy là một việc làm tỷ mỷ, vì mức ủộ nhiễm trựng của cỏc mụ trờn bề mặt rất khỏc nhau. ðối với mỗi loại thao tỏc, cần thực hiện một thử nghiệm về khử trùng với sự kết hợp của nhiều hóa chất khác nhau (các chất kháng sinh, etanol 70°, hypochloride sodium, hypochloride calcium, HgCl2 …), với nhiều nồng ủộ khỏc nhau của cỏc húa chất kết hợp này cũng như thời gian khử trùng khác nhau. Sự khó khăn khi khử trùng bắt nguồn từ sự cần thiết tuyệt ủối phải hủy diệt hoàn toàn cỏc vi sinh vật bằng cỏc húa chất sử dụng mà không làm chết các tế bào mô thực vật. Trong các thí nghiệm khử trùng bề mặt lá Thu Hải ðường và Sâm Ngọc Linh chúng tôi sử dụng etanol 70° và HgCl2 0,1% cho giai ủoạn khử trựng bề mặt lỏ, cuống lỏ và thõn.
Thu Hải ðường và Sâm Ngọc Linh là những loại cây có chiều cao thấp nên lỏ, cuống lỏ và thõn rất gần với mặt ủất, thường xuyờn tiếp xỳc với cỏc nguồn lõy nhiễm trong ủất. Bề mặt lỏ cõy Sõm Ngọc Linh lại cú nhiều lụng nờn càng làm tăng ủộ bỏm dớnh của cỏc yếu tố lõy nhiễm như cỏc bào tử nấm, vi khuẩn, vỡ vậy thời gian khử trựng phải ủủ dài (3 – 5 phỳt) ủể tiờu diệt ủược vi sinh. Tuy nhiờn,
lá Sâm Ngọc linh khá mỏng và yếu nên nếu thời gian khử mẫu quá dài (trên 5 phút) sẽ làm tăng tỷ lệ mẫu chết sau quá trình khử mẫu.
Một ủặc ủiểm nữa là mẫu cấy sau giai ủoạn khử trựng phải tiến hành sử dụng ngay trong thời gian ngắn, nếu kéo dài thời gian sẽ ảnh hưởng tới chất lượng mẫu cấy, mẫu ủể càng lõu trước khi ủem khử trựng bề mặt thỡ càng xảy ra hiện tượng ủen và thẫm màu vỡ bị oxy húa. Lỏ sử dụng trong cỏc thớ nghiệm không quá già vì khó tái sinh, cũng không nên sử dụng lá quá non, tuy khả năng tái sinh cao nhưng rất dễ bị tổn thương bề mặt trong quá trình khử mẫu dẫn tới tỷ lệ chết của mẫu trong môi trường nuôi cấy cao.
Sau khi tiến hành các thao tác khử trùng ngoài và trong tủ cấy, tiến hành cấy mẫu. Mẫu cấy ủược ủem vào phũng nuụi. Cỏc ủặc ủiểm cú thể quan sỏt ủược sau một tuần nuôi cấy là: mẫu nhiễm nấm, khuẩn, mẫu hóa nâu.
Hiện tượng mẫu nhiễm nấm, khuẩn
Sau 3 – 5 ngày nuụi cấy cỏc bỡnh nuụi bắt ủầu xuất hiện cỏc trường hợp nhiễm nấm và khuẩn. Nếu bình nhiễm nấm thì sẽ thấy sự phát triển của các sợi trắng, cỏc hạt ủen hay vựng nhiễm màu xanh, nấm này phỏt triển rất nhanh. Cũn nếu cú cỏc màng cú dạng sữa lan rộng trờn bề mặt mụi trường thỡ bỡnh nuụi ủó nhiễm khuẩn, khuẩn không phát triển mạnh như nấm mốc nhưng cũng ảnh hưởng ủến khả năng hấp thụ dinh dưỡng của mẫu cấy và làm hư hại mẫu.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, tỷ lệ nhiễm sau một tuần nuôi cấy trên lá là khá cao (50 – 60%) còn cuống lá và thân tỷ lệ nhiễm gần như không có. Hiện tượng này có thể là do sự khác nhau về cấu trúc lớp bề mặt của lá, cuống lá và thân. Cuống lá và thân có bề mặt khá bền vững, nhẵn bóng, không có nhiều lông bám trên bề mặt. Hơn nữa trên lá có khí khổng là nơi ẩn náu của rất nhiều vi sinh nên dễ nhiễm hơn. Tỷ lệ chết của mẫu cây lá cũng cao hơn rất nhiều mẫu cấy cuống lá và thân.
Nguyờn nhõn nhiễm cú thể một phần do cỏc thao tỏc cấy chưa ủảm bảo, do sự hiện diện của côn trùng trong phòng nuôi làm lây lan nguồn nhiễm, do mẫu bị nhiễm nội sinh, thời gian thu mẫu (thu mẫu mùa mưa rất thuận lợi cho vi sinh phỏt triển do ủộ ẩm cao và ủộ phỏt tỏn cao hơn nhiều lần). Ngoài ra cũn phải kể ủến phần tỏc ủộng lớn của loại chất khử trựng bề mặt mẫu trong tủ cấy là HgCl2.
HgCl2 là chất khử trựng mạnh, ủem lại hiệu quả rất cao. Tuy nhiờn, nú là chất ủộc hại cho mụ khi tiến hành khử trựng bề mặt mẫu cấy. Al-Sabbagh và cộng sự (1999) ủó thu nhận kết quả khoảng 90% mẫu nuụi khụng nhiễm khuẩn khi nhiên cứu khả năng tái sinh của cây Anh đào (Prunus avium L.) nhưng khả năng tỏi sinh của cỏc mẫu cấy này khỏ thấp (50%) do HgCl2 ủó thấm vào mụ qua các vết thương tạo thành khi xử lý mẫu cấy. Khi sử dụng HgCl2 khử trùng bề mặt cỏc lỏ, do ủặc ủiểm của lỏ khỏ mỏng, dễ xay xỏt trong quỏ trỡnh khử mẫu nờn càng làm tăng tính thấm của hóa chất vào trong mô gây hiện tượng chết mẫu.
Cuống lá và thân do bề mặt khá bền vững nên ít xay xát trong quá trình khử mẫu, vì vậy sự thấm của hóa chất vào trong là rất hạn chế.
Chỳng tụi ủó tiến hành thử nghiệm sơ lược ủể xỏc ủịnh thời gian khử trựng tối ưu nhất cho quá trình tái sinh mẫu như sau:
Thu Hải ðường
Khi khử trùng 4 phút thì tỷ chết của mẫu rất cao lên tới 70%. Tuy nhiên, hiện tượng nhiễm nấm, khuẩn xảy ra rất ít nhưng mẫu không nhiễm có sự tái sinh rất yếu.
Khi khử trùng 3 phút thì tỷ lệ nhiễm 20 – 30% trên mẫu thân, mẫu thân không nhiễm có sự tái sinh tốt và không có trường hợp nào nhiễm nấm, khuẩn trong suốt quá trình nuôi cấy tiếp theo.
Sâm Ngọc Linh
Khi khử trùng 6 phút thì mẫu lá có hiện tượng hóa nâu, khi cấy tỷ lệ chết rất cao (80%) với mẫu lá, cuống lá tái sinh yếu. Hiện tượng nhiễm nấm, khuẩn rất ít.
Khi giảm thời gian xuống cũn 5 phỳt thỡ tỷ lệ nhiễm tăng rừ rệt (50%) nhưng các mẫu sống sót tỷ lệ tái sinh cao.
Hiện tượng hóa nâu
Trong quá trình nuôi cấy các mẫu lá tái sinh thường thấy hiện tượng hóa nõu hay mụi trường bị ủen (khụng xảy ra với cuống lỏ và thõn). Sinh trưởng của mẫu bị ức chế và chết sau một thời gian.
Hiện tượng hóa nâu xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một lượng lớn tanin hoặc các hợp chất hydroxylphenol. Những chất này ngăn cản quá trình tái sinh cơ quan của rất nhiều loại cây (Laukkanen và cộng sự, 1999). Theo Arnaldos và cộng sự (2001) phenol là hợp chất thứ cấp ủiều khiển sự phỏt triển của cõy trồng và bảo vệ cõy chống lại sõu bệnh và cỏc ủiều kiện khắc nghiệt của thiờn nhiờn.
Tuy nhiên, khi cắt mẫu cấy tạo vết thương, phenol tiết qua các vết cắt (vết thương càng lớn thỡ càng nhiều phenol tiết ra) và lập tức bị oxy húa thành quinine ủầu ủộc tế bào. Quinine chớnh là nguyờn nhõn làm mẫu húa nõu và làm ủen mụi trường nuôi cấy (Laukkanen và cộng sự, 1999).
ðể giải quyết hiện tượng hóa nâu mẫu người ta sử dụng nhiều phương pháp nhằm làm giảm lượng phenol tiết ra môi trường nuôi cấy qua các vết thương. Tuy nhiên, do thời gian thí nghiệm ngắn nên chúng tôi không tiến hành nghiên cứu về vấn ủề này.