Kết quả & Thảo luận
3.2.1. Ảnh hưởng của quá trình khử mẫu lên khả năng tái sinh của cây Thu Hải ðường và Sâm Ngọc Linh
Sự khác biệt chủ yếu của phương pháp nhân giống sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô so với các phương pháp truyền thống ựã ựược ựề cập rất nhiều trong các tài liệu khoa học. điều kiện tiên quyết dẫn tới sự thành công của phương pháp này là ựảm bảo yếu tố vô trùng trong hầu hết các khâu của quá trình nuôi cấy, từ giai ựoạn vô mẫu ựến giai ựoạn vườn ươm. Tuy nhiên ựa số các mẫu cấy có nguồn gốc ex vitro tách từ cây mẹ ngoài ựồng lại chứa lượng lớn vi sinh gây bệnh tạo ra nhiều bất lợi cho quá trình nuôi cấy. Chọn mô sạch bệnh từ cây mẹựể
nuôi cấy là việc hết sức quan trọng, quyết ựịnh hiệu quả của quá trình nuôi cấy. Việc khử trùng các mô thực vật trước khi cấy là một việc làm tỷ mỷ, vì mức
ựộ nhiễm trùng của các mô trên bề mặt rất khác nhau. đối với mỗi loại thao tác, cần thực hiện một thử nghiệm về khử trùng với sự kết hợp của nhiều hóa chất khác nhau (các chất kháng sinh, etanol 70ồ, hypochloride sodium, hypochloride calcium, HgCl2 Ầ), với nhiều nồng ựộ khác nhau của các hóa chất kết hợp này cũng như thời gian khử trùng khác nhau. Sự khó khăn khi khử trùng bắt nguồn từ
sự cần thiết tuyệt ựối phải hủy diệt hoàn toàn các vi sinh vật bằng các hóa chất sử
dụng mà không làm chết các tế bào mô thực vật. Trong các thắ nghiệm khử trùng bề mặt lá Thu Hải đường và Sâm Ngọc Linh chúng tôi sử dụng etanol 70ồ và HgCl2 0,1% cho giai ựoạn khử trùng bề mặt lá, cuống lá và thân.
Thu Hải đường và Sâm Ngọc Linh là những loại cây có chiều cao thấp nên lá, cuống lá và thân rất gần với mặt ựất, thường xuyên tiếp xúc với các nguồn lây nhiễm trong ựất. Bề mặt lá cây Sâm Ngọc Linh lại có nhiều lông nên càng làm tăng ựộ bám dắnh của các yếu tố lây nhiễm như các bào tử nấm, vi khuẩn, vì vậy thời gian khử trùng phải ựủ dài (3 Ờ 5 phút) ựể tiêu diệt ựược vi sinh. Tuy nhiên,
lá Sâm Ngọc linh khá mỏng và yếu nên nếu thời gian khử mẫu quá dài (trên 5 phút) sẽ làm tăng tỷ lệ mẫu chết sau quá trình khử mẫu.
Một ựặc ựiểm nữa là mẫu cấy sau giai ựoạn khử trùng phải tiến hành sử
dụng ngay trong thời gian ngắn, nếu kéo dài thời gian sẽ ảnh hưởng tới chất lượng mẫu cấy, mẫu ựể càng lâu trước khi ựem khử trùng bề mặt thì càng xảy ra hiện tượng ựen và thẫm màu vì bị oxy hóa. Lá sử dụng trong các thắ nghiệm không quá già vì khó tái sinh, cũng không nên sử dụng lá quá non, tuy khả năng tái sinh cao nhưng rất dễ bị tổn thương bề mặt trong quá trình khử mẫu dẫn tới tỷ
lệ chết của mẫu trong môi trường nuôi cấy cao.
Sau khi tiến hành các thao tác khử trùng ngoài và trong tủ cấy, tiến hành cấy mẫu. Mẫu cấy ựược ựem vào phòng nuôi. Các ựặc ựiểm có thể quan sát ựược sau một tuần nuôi cấy là: mẫu nhiễm nấm, khuẩn, mẫu hóa nâu.
Hiện tượng mẫu nhiễm nấm, khuẩn
Sau 3 Ờ 5 ngày nuôi cấy các bình nuôi bắt ựầu xuất hiện các trường hợp nhiễm nấm và khuẩn. Nếu bình nhiễm nấm thì sẽ thấy sự phát triển của các sợi trắng, các hạt ựen hay vùng nhiễm màu xanh, nấm này phát triển rất nhanh. Còn nếu có các màng có dạng sữa lan rộng trên bề mặt môi trường thì bình nuôi ựã nhiễm khuẩn, khuẩn không phát triển mạnh như nấm mốc nhưng cũng ảnh hưởng
ựến khả năng hấp thụ dinh dưỡng của mẫu cấy và làm hư hại mẫu.
Trong thắ nghiệm của chúng tôi, tỷ lệ nhiễm sau một tuần nuôi cấy trên lá là khá cao (50 Ờ 60%) còn cuống lá và thân tỷ lệ nhiễm gần như không có. Hiện tượng này có thể là do sự khác nhau về cấu trúc lớp bề mặt của lá, cuống lá và thân. Cuống lá và thân có bề mặt khá bền vững, nhẵn bóng, không có nhiều lông bám trên bề mặt. Hơn nữa trên lá có khắ khổng là nơi ẩn náu của rất nhiều vi sinh nên dễ nhiễm hơn. Tỷ lệ chết của mẫu cây lá cũng cao hơn rất nhiều mẫu cấy cuống lá và thân.
Nguyên nhân nhiễm có thể một phần do các thao tác cấy chưa ựảm bảo, do sự hiện diện của côn trùng trong phòng nuôi làm lây lan nguồn nhiễm, do mẫu bị
nhiễm nội sinh, thời gian thu mẫu (thu mẫu mùa mưa rất thuận lợi cho vi sinh phát triển do ựộ ẩm cao và ựộ phát tán cao hơn nhiều lần). Ngoài ra còn phải kể ựến phần tác ựộng lớn của loại chất khử trùng bề mặt mẫu trong tủ cấy là HgCl2.
HgCl2 là chất khử trùng mạnh, ựem lại hiệu quả rất cao. Tuy nhiên, nó là chất ựộc hại cho mô khi tiến hành khử trùng bề mặt mẫu cấy. Al-Sabbagh và cộng sự (1999) ựã thu nhận kết quả khoảng 90% mẫu nuôi không nhiễm khuẩn khi nhiên cứu khả năng tái sinh của cây Anh đào (Prunus avium L.) nhưng khả
năng tái sinh của các mẫu cấy này khá thấp (50%) do HgCl2ựã thấm vào mô qua các vết thương tạo thành khi xử lý mẫu cấy. Khi sử dụng HgCl2 khử trùng bề mặt các lá, do ựặc ựiểm của lá khá mỏng, dễ xay xát trong quá trình khử mẫu nên càng làm tăng tắnh thấm của hóa chất vào trong mô gây hiện tượng chết mẫu. Cuống lá và thân do bề mặt khá bền vững nên ắt xay xát trong quá trình khử mẫu, vì vậy sự thấm của hóa chất vào trong là rất hạn chế.
Chúng tôi ựã tiến hành thử nghiệm sơ lược ựể xác ựịnh thời gian khử trùng tối ưu nhất cho quá trình tái sinh mẫu như sau:
Thu Hải đường
Khi khử trùng 4 phút thì tỷ chết của mẫu rất cao lên tới 70%. Tuy nhiên, hiện tượng nhiễm nấm, khuẩn xảy ra rất ắt nhưng mẫu không nhiễm có sự tái sinh rất yếu.
Khi khử trùng 3 phút thì tỷ lệ nhiễm 20 Ờ 30% trên mẫu thân, mẫu thân không nhiễm có sự tái sinh tốt và không có trường hợp nào nhiễm nấm, khuẩn trong suốt quá trình nuôi cấy tiếp theo.
Sâm Ngọc Linh
Khi khử trùng 6 phút thì mẫu lá có hiện tượng hóa nâu, khi cấy tỷ lệ chết rất cao (80%) với mẫu lá, cuống lá tái sinh yếu. Hiện tượng nhiễm nấm, khuẩn rất ắt.
Khi giảm thời gian xuống còn 5 phút thì tỷ lệ nhiễm tăng rõ rệt (50%) nhưng các mẫu sống sót tỷ lệ tái sinh cao.
Hiện tượng hóa nâu
Trong quá trình nuôi cấy các mẫu lá tái sinh thường thấy hiện tượng hóa nâu hay môi trường bị ựen (không xảy ra với cuống lá và thân). Sinh trưởng của mẫu bịức chế và chết sau một thời gian.
Hiện tượng hóa nâu xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một lượng lớn tanin hoặc các hợp chất hydroxylphenol. Những chất này ngăn cản quá trình tái sinh cơ
quan của rất nhiều loại cây (Laukkanen và cộng sự, 1999). Theo Arnaldos và cộng sự (2001) phenol là hợp chất thứ cấp ựiều khiển sự phát triển của cây trồng và bảo vệ cây chống lại sâu bệnh và các ựiều kiện khắc nghiệt của thiên nhiên. Tuy nhiên, khi cắt mẫu cấy tạo vết thương, phenol tiết qua các vết cắt (vết thương càng lớn thì càng nhiều phenol tiết ra) và lập tức bị oxy hóa thành quinine ựầu
ựộc tế bào. Quinine chắnh là nguyên nhân làm mẫu hóa nâu và làm ựen môi trường nuôi cấy (Laukkanen và cộng sự, 1999).
để giải quyết hiện tượng hóa nâu mẫu người ta sử dụng nhiều phương pháp nhằm làm giảm lượng phenol tiết ra môi trường nuôi cấy qua các vết thương. Tuy nhiên, do thời gian thắ nghiệm ngắn nên chúng tôi không tiến hành nghiên cứu về
vấn ựề này.