Kết quả sau 6 tuần nuụi cấy, cỏc tTCL và lTCL ủoạn thõn trờn mụi trường cú bổ sung TDZ và NAA ủó thu ủược cỏc chồi. Và kết quả cho thấy ủộ dày của mẫu cấy cú vai trũ quan trọng trong khả năng tạo chồi. Cỏc mẫu cấy lTCL cú ủộ dày 0,5 – 1,0 mm có biểu hiện dễ bị tổn thương; các mẫu cấy hóa nâu rồi chết.
Với ủộ dày mẫu cấy từ 1,5 – 3,5 mm mẫu cấy tỏi sinh 100%, cú khả năng tạo chồi cao (Bảng 4). Số liệu cho thấy mẫu cấy lTCL 1,5 – 2,0 mm có khả năng tái
sinh chồi tốt hơn mẫu cấy cú ủộ dày 2,5 – 3,5 mm và ủoạn thõn cắt dọc cú khả năng tỏi sinh tốt hơn ủoạn thõn cắt ngang.
Bảng 4. Ảnh hưởng cỏch lấy mẫu và ủộ dày của lớp mỏng cắt từ thõn cõy hoa Thu Hải ðường ủến khả năng tỏi sinh chồi in vitro
Loại mẫu cấy Tỷ lệ tái sinh (%)
Số chồi/mẫu*
Trọng lượng
tươi*(mg) Ghi chú
lTCL1 0 _ _ Chết
lTCL2 60 60 510 Chồi nhiều, to,
cao, xuất hiện rễ
lTCL3 100 75 330 Chồi nhiều, nhỏ
tTCL 50 9 40 Chồi ít, nhỏ
Ghi chú: * số liệu trung bình của 2 mẫu
0 100 200 300 400 500 600
Tỷ lệ tái sinh (%)
số chồi/mẫu Trọng lượng tươi (mg)
lTCL1 lTCL2 lTCL3 tTCL
ðồ thị 2. Ảnh hưởng cỏch lấy mẫu từ thõn cõy hoa Thu Hải ðường ủến khả năng tái sinh chồi in vitro
Phõn tớch cấu trỳc là bước ủầu tiờn trong nghiờn cứu phỏt sinh hỡnh thỏi ở thực vật (Yeung, 1995). Sự tỏi sinh trực tiếp chồi từ ủoạn thõn của cõy ủược xỏc lập bởi nhiều yếu tố như: chất ủiều hũa sinh trưởng, vị trớ mẫu cấy, loại mẫu cấy… Bờn cạnh ủú tuổi của mụ cấy và phương phỏp cắt mẫu cũng ảnh hưởng ủến khả năng ủỏp ứng của mụ trong quỏ trỡnh nuụi cấy (Dương Cụng Kiờn, 2002).
Thực vật cú khả năng tỏi sinh mạnh mẽ từ một bộ phận tỏch rời trong ủiều kiện nhất ủịnh. Thụng thường khi mất vựng ủang tăng trưởng thỡ sự tỏi tạo của phần ủú ủược hoàn thành bởi sự phỏt triển của vựng tăng trưởng mới. Những chồi mọc ra từ cỏc mụ tương ủối trưởng thành khụng liờn quan ủến mụ phõn sinh ủược gọi là chồi bất ủịnh. Cỏc chồi bất ủịnh cú thể bắt nguồn từ lớp biểu bỡ, từ một lớp biểu bỡ bằng cỏch nào ủú ủược kớch thớch ủể trở lại ủiều kiện phụi, cú nghĩa là phân chia nhiều lần tạo nên các tế bào nhỏ. Vì vậy, từ trong vách nhú ra bên ngoài những chồi nhỏ, sau ủú là phỏt triển thành chồi hoàn chỉnh.
Cỏc tế bào ủoạn thõn về mặt hỡnh thỏi phỏt triển là những tế bào ủó ủược biệt húa về cấu trỳc, tổ chức và chức năng ủể ủảm nhận cỏc nhiệm vụ khỏc nhau.
Do ủú trong quỏ trỡnh nuụi cấy cảm ứng tạo chồi, dưới tỏc ủộng của TDZ và NAA, các tế bào chuyên hóa này trải qua sự biệt hóa tạo chồi.
Nhựt và cộng sự (2001) tiến hành khảo sát ảnh hưởng của mẫu cấy ban ủầu lờn khả năng tỏi sinh của Lilium longiflorum bằng lỏt mỏng tế bào tTCL và nhận thấy ủộ dày của lỏt mỏng khoảng 1,0 mm sẽ cho tỷ lệ sống sút cao nhất và chồi nhiều nhất; ở ủộ dày 0,5 mm, mẫu cấy rất yếu và tỷ lệ sống sút chỉ khoảng 10%, ở ủộ dày 2,0 và 3,0 mm, tỷ lệ sống sút cao nhưng lượng chồi hỡnh thành khụng cao. Rừ ràng kớch thước mẫu và ủộ dày mẫu cấy ban ủầu cú ảnh hưởng lớn ủến hiệu quả của việc nuụi cấy mụ. Trong thớ nghiệm này của chỳng tụi lỏt cắt dọc cú ủộ dày 1,5 – 2,5 mm cú khả năng tỏi sinh mạnh nhất (Hỡnh 7).
Tất cả cỏc chồi ủều hỡnh thành từ bề mặt vết thương là vị trớ tiếp xỳc với môi trường nuôi cấy. Mẫu cấy thân cắt ngang có khả năng tái sinh thấp và tỷ lệ
có thể do diện tích bề mặt vết thương của chúng tiếp xúc với môi trường nhỏ hơn mẫu cắt dọc nên khả năng hấp thu dinh dưỡng và các chất kích thích tăng trưởng rất hạn chế, do ủú tế bào ở vị trớ này phõn chia và tỏi sinh chậm nhất, hơn nữa lượng tế bào cú trong mẫu cũng ớt hơn và trong quỏ trỡnh cắt mẫu cũng cú thể ủó làm phỏ hủy cấu trỳc tế bào của thõn (ðồ thị 2). Khi lại khi cắt cỏc ủoạn thõn theo chiều dọc việc làm tổn thương, hư hại các tế bào sẽ rất ít do vết cắt dọc theo hướng phát triển của tế bào thân và số lượng tế bào có trong mẫu nhiều hơn thân cắt ngang.
Lỏt cắt ủoạn thõn cú bề dày 2,5 – 3,5 mm tỏi sinh yếu hơn lỏt cắt 1,5 – 2 mm do chỉ có sự tái sinh từ lớp tế bào biểu bì ở mặt trên của mẫu cấy mà sự phát triển của các lớp mô tế bào khác nằm sau lớp tế bào biểu bì rất yếu. Lát cắt 1,5 – 2 mm ngoài sự phát triển của lớp tế bào biểu bì còn có các lớp tế bào khác như nhu mụ, mụ nõng ủỡ, mụ dẫn truyền … Nờn khả năng tỏi sinh mạnh hơn.
Ảnh chụp tiêu bản hiển vi của mẫu cấy thân cắt ngang trong môi trường TN3 cho thấy chồi phát sinh từ nhu mô vỏ dưới biểu bì và biểu bì. Nội mô không hề bị kích thích, nhu mô vỏ sát biểu bì và biểu bì là nơi các tế bào phân chia và biệt hóa chồi.
Hỡnh 7. Ảnh hưởng cỏch lấy mẫu từ thõn cõy hoa Thu Hải ðường ủến khả năng tái sinh chồi in vitro
a, a1, a2: lTCL2; b, b1, b2: lTCL3; c, c1, c2: tTCL; d, e, f: hình giải phẫu ủoạn thõn