2.2. Vật liệu và phương pháp 1. Vật liệu nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Khử trùng mẫu (với mẫu ex vitro) Thao tác khử trùng ngoài tủ cấy
Lỏ, cuống lỏ, thõn của cõy ủược giữ nguyờn ủể thực hiện cỏc thao tỏc khử trựng mẫu khi xử lý với nước và xà phũng. Mẫu ủược lựa chọn ủể dưới vũi nước mỏy chảy nhẹ một giờ ủể khử sạch bề mặt, sau ủú lấy bụng gũn thấm nước và xà phũng lau sạch trờn bề mặt lỏ, thõn và cuống lỏ. Sau ủú rửa sạnh lại với nước ủến khi hết bọt xà phòng.
Thao tác khử trùng trong tủ cấy
Khử trùng mẫu nhẹ qua cồn 700 trong thời gian 30 giây, rửa sạch lại bằng nước cất vụ trựng nhiều lần. Tiếp ủến mẫu ủược khử trựng trong bỡnh tam giỏc (ủó ủược hấp khử trựng) bằng HgCl2 nồng ủộ 0,1 %, bổ sung vài giọt Tween – 80 trong thời gian 5 phỳt với mẫu Sõm Ngọc Linh và 3 phỳt ủối với cõy hoa Thu Hải ðường (chỳ ý mẫu phải ngập hoàn toàn trong dung dịch mới ủạt hiệu quả khử trựng). Sau ủú rửa sạch lại với nước cất vụ trựng.
2.2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Tất cả cỏc mẫu cấy của thớ nghiệm ủều nuụi cấy trờn mụi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). Tùy theo từng thí nghiệm mà bổ sung các chất kích thích tăng trưởng thực vật sau: BA, NAA, TDZ, IAA, 2,4-D. Các môi trường này ủều ủược ủiều chỉnh ủến pH = 5,8 (chỉnh bằng NaOH 1 N hay HCl 1 N). Mụi trường chứa trong cỏc bỡnh 250 ml, ủem hấp trong Autoclave ở 1210C, 1 atm trong vòng 30 phút.
2.2.2.3. ðiều kiện nuôi cấy
Cường ủộ chiếu sỏng : 2.500 – 3.000 lux Thời gian chiếu sáng : 16 giờ/ngày Nhiệt ủộ : 25 ± 20C ðộ ẩm : 75 – 80%
PH : 5,8
2.2.2.4. Chỉ tiờu theo dừi
Tỷ lệ (%) tái sinh từ các bộ phận khác nhau của cây.
Trọng lượng tươi của mẫu tái sinh.
Số lượng chồi tái sinh trên mẫu.
Chiều cao chồi tái sinh.
So sánh khả năng tái sinh của mẫu in vitro và ex vitro trên cây sâm ngọc Linh.
2.2.2.5. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy lá Torenia lên khả năng năng tái sinh chồi in vitro.
Mục ủớch: xỏc ủịnh kớch thước mẫu cấy lỏ ảnh hưởng ủến khả năng tỏi sinh chồi Torenia in vitro.
Tiến hành thí nghiệm
• Cỏc lỏ cõy Torenia in vitro ủược cắt bằng dụng cụ cắt lỗ cú ủường kính là 0,8 cm, 1 cm và 1,2 cm.
• Mẫu ủược nuụi trờn mụi trường tỏi sinh chồi : MS bổ sung 0,5 ml/l BA, 0,5 ml/l NAA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar (TN1). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thớ nghiệm 2. Khảo sỏt cỏch lấy mẫu từ ủoạn thõn cõy Torenia ủến khả năng tỏi sinh chồi in vitro.
Mục ủớch: xỏc ủịnh khả năng tỏi sinh chồi từ ủoạn thõn của mẫu cấy, ủồng thời so sỏnh khả năng tỏi sinh với lỏ.
Tiến hành thí nghiệm
• Lấy ủốt thõn thứ ba (từ trờn xuống) của cõy cắt thành ủoạn cú chiều dài 1cm. Chẻ dọc thõn làm 2 (lTCL) và cắt ngang ủoạn thõn ủoạn cú chiều dài 1 – 2 mm (tTCL).
• Mẫu ủược nuụi trờn mụi trường TN1, Mỗi thớ nghiệm lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy lá cây Sâm Ngọc Linh (Panax) lên khả năng năng tái sinh chồi in vitro.
Mục ủớch: xỏc ủịnh kớch thước mẫu cấy lỏ ảnh hưởng ủến khả năng tỏi sinh chồi cây Sâm Ngọc Linh (lá in vitro và ex vitro).
Tiến hành thí nghiệm
• Cỏc lỏ cõy Sõm Ngọc Linh ủược cắt bằng dụng cụ cắt lỗ cú ủường kính là 0,8 cm, 1 cm và 1,2 cm.
• Mẫu cấy ủược nuụi trờn mụi trường phỏt sinh mụ sẹo: MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D, 0,2 mg/l TDZ, 30 sucrose và 8 g/l agar (TN2). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thớ nghiệm 4. Khảo sỏt cỏch lấy mẫu từ cuống lỏ cõy Sõm Ngọc Linh ủến khả năng tái sinh mô sẹo in vitro (cuống lá in vitro và ex vitro)
Mục ủớch: xỏc ủịnh khả năng tỏi sinh mụ sẹo của cuống lỏ.
Tiến hành thí nghiệm
• Lấy cuống lỏ cắt thành ủoạn cú chiều dài 1 cm, chẻ dọc thõn làm 2 (lTCL) và cắt ngang ủoạn thõn cú chiều dài 1 – 2 mm (tTCL).
• Mẫu cấy ủược nuụi trờn mụi trường phỏt sinh mụ sẹo (TN2). Mỗi thớ nghiệm lặp lại 3 lần.
Thớ nghiệm 5. Khảo sỏt cỏch lấy mẫu từ thõn cõy hoa Thu Hải ðường ủến khả năng tái sinh chồi in vitro.
Mục ủớch: xỏc ủịnh khả năng tỏi sinh chồi từ ủoạn thõn của mẫu cấy.
Tiến hành thí nghiệm
• Lấy ủoạn thõn cắt thành ủoạn cú chiều dài 1 cm, chẻ dọc thõn làm nhiều mảnh cú ủộ dày khỏc nhau 0,5 – 1 mm (lTCL1), 1,5 – 2 mm (lTCL2), 2,5 – 3,5 mm (lTCL3).
• Cắt ngang ủoạn thõn cú chiều dài 1 – 2 mm (tTCL).
• Mẫu cấy ủược nuụi trờn mụi trường tỏi sinh chồi: MS cú bổ sung 0,1 mg/l TDZ, 0,2 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar (TN3).
Hoàng Văn Thưởng 44
Hỡnh 6. Sơ ủồ cỏc bước ủể thu nhận mẫu từ cõy sõm Ngọc Linh