d. Panax pseudognseng; f Panax notogingseng; g Panax japonicus
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Khử trùng mẫu (với mẫu ex vitro)
Thao tác khử trùng ngoài tủ cấy
Lá, cuống lá, thân của cây ñược giữ nguyên ñể thực hiện các thao tác khử
trùng mẫu khi xử lý với nước và xà phòng. Mẫu ñược lựa chọn ñể dưới vòi nước máy chảy nhẹ một giờñể khử sạch bề mặt, sau ñó lấy bông gòn thấm nước và xà phòng lau sạch trên bề mặt lá, thân và cuống lá. Sau ñó rửa sạnh lại với nước ñến khi hết bọt xà phòng.
Thao tác khử trùng trong tủ cấy
Khử trùng mẫu nhẹ qua cồn 700 trong thời gian 30 giây, rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng nhiều lần. Tiếp ñến mẫu ñược khử trùng trong bình tam giác (ñã ñược hấp khử trùng) bằng HgCl2 nồng ñộ 0,1 %, bổ sung vài giọt Tween – 80 trong thời gian 5 phút với mẫu Sâm Ngọc Linh và 3 phút ñối với cây hoa Thu Hải
ðường (chú ý mẫu phải ngập hoàn toàn trong dung dịch mới ñạt hiệu quả khử
trùng). Sau ñó rửa sạch lại với nước cất vô trùng.
2.2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Tất cả các mẫu cấy của thí nghiệm ñều nuôi cấy trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). Tùy theo từng thí nghiệm mà bổ sung các chất kích thích tăng trưởng thực vật sau: BA, NAA, TDZ, IAA, 2,4-D. Các môi trường này
ñều ñược ñiều chỉnh ñến pH = 5,8 (chỉnh bằng NaOH 1 N hay HCl 1 N). Môi trường chứa trong các bình 250 ml, ñem hấp trong Autoclave ở 1210C, 1 atm trong vòng 30 phút.
2.2.2.3. ðiều kiện nuôi cấy
Cường ñộ chiếu sáng : 2.500 – 3.000 lux Thời gian chiếu sáng : 16 giờ/ngày Nhiệt ñộ : 25 ± 20C
ðộẩm : 75 – 80% PH : 5,8
2.2.2.4. Chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ (%) tái sinh từ các bộ phận khác nhau của cây. Trọng lượng tươi của mẫu tái sinh.
Số lượng chồi tái sinh trên mẫu. Chiều cao chồi tái sinh.
So sánh khả năng tái sinh của mẫu in vitro và ex vitro trên cây sâm ngọc Linh.
Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy lá Torenia lên khả
năng năng tái sinh chồi in vitro.
Mục ñích: xác ñịnh kích thước mẫu cấy lá ảnh hưởng ñến khả năng tái sinh chồi Torenia in vitro.
Tiến hành thí nghiệm
• Các lá cây Torenia in vitro ñược cắt bằng dụng cụ cắt lỗ có ñường kính là 0,8 cm, 1 cm và 1,2 cm.
• Mẫu ñược nuôi trên môi trường tái sinh chồi : MS bổ sung 0,5 ml/l BA, 0,5 ml/l NAA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar (TN1). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm 2. Khảo sát cách lấy mẫu từñoạn thân cây Torenia ñến khả năng tái sinh chồi in vitro.
Mục ñích: xác ñịnh khả năng tái sinh chồi từ ñoạn thân của mẫu cấy,
ñồng thời so sánh khả năng tái sinh với lá.
Tiến hành thí nghiệm
• Lấy ñốt thân thứ ba (từ trên xuống) của cây cắt thành ñoạn có chiều dài 1cm. Chẻ dọc thân làm 2 (lTCL) và cắt ngang ñoạn thân ñoạn có chiều dài 1 – 2 mm (tTCL).
• Mẫu ñược nuôi trên môi trường TN1, Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy lá cây Sâm Ngọc Linh (Panax) lên khả năng năng tái sinh chồi in vitro.
Mục ñích: xác ñịnh kích thước mẫu cấy lá ảnh hưởng ñến khả năng tái sinh chồi cây Sâm Ngọc Linh (lá in vitro và exvitro).
Tiến hành thí nghiệm
• Các lá cây Sâm Ngọc Linh ñược cắt bằng dụng cụ cắt lỗ có ñường kính là 0,8 cm, 1 cm và 1,2 cm.
• Mẫu cấy ñược nuôi trên môi trường phát sinh mô sẹo: MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D, 0,2 mg/l TDZ, 30 sucrose và 8 g/l agar (TN2). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm 4. Khảo sát cách lấy mẫu từ cuống lá cây Sâm Ngọc Linh ñến khả
năng tái sinh mô sẹo in vitro (cuống lá in vitro và ex vitro)
Mục ñích: xác ñịnh khả năng tái sinh mô sẹo của cuống lá.
Tiến hành thí nghiệm
• Lấy cuống lá cắt thành ñoạn có chiều dài 1 cm, chẻ dọc thân làm 2 (lTCL) và cắt ngang ñoạn thân có chiều dài 1 – 2 mm (tTCL).
• Mẫu cấy ñược nuôi trên môi trường phát sinh mô sẹo (TN2). Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm 5. Khảo sát cách lấy mẫu từ thân cây hoa Thu Hải ðường ñến khả
năng tái sinh chồi in vitro.
Mục ñích: xác ñịnh khả năng tái sinh chồi từñoạn thân của mẫu cấy.
Tiến hành thí nghiệm
• Lấy ñoạn thân cắt thành ñoạn có chiều dài 1 cm, chẻ dọc thân làm nhiều mảnh có ñộ dày khác nhau 0,5 – 1 mm (lTCL1), 1,5 – 2 mm (lTCL2), 2,5 – 3,5 mm (lTCL3).
• Cắt ngang ñoạn thân có chiều dài 1 – 2 mm (tTCL).
• Mẫu cấy ñược nuôi trên môi trường tái sinh chồi: MS có bổ sung 0,1 mg/l TDZ, 0,2 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar (TN3).
Hoàng V n Th ng 44