2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Một số chủng vi khuẩn lam được phân lập ở các thủy vực nước ngọt Việt Nam, được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học, Đại học Huế. Danh sách và hình ảnh các chủng vi khuẩn lam nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1 và hình 2.
Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn lam nghiên cứu Loài Tên chủng Nguồn gốc
M. aeruginosa ĐA Ma1 Đức An, Gia Lai ĐA Ma2 Đức An, Gia Lai BH Ma1 Biển Hồ, Gia Lai
BHB Ma2 Biển Hồ B, Gia Lai HK Ma2 Hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội
M. wesenbergii HK Mw1 Hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội HK Mw2 Hồ Hoàn Kiếm, Hà nội ĐA Mw Đức An, Gia Lai
M. botrys HK Mb1 Cửa Ngăn, TT Huế CN Mb1 Cửa Ngăn, TT Huế
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2 đến tháng 9 năm 2012.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học, Đại học Huế.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Điều kiện nuôi cấy 2.2.1. Điều kiện nuôi cấy
Hình 2.1. Hình thái các chủng vi khuẩn lam nghiên cứu
1.ĐA Ma1, 2. ĐA Ma2, 3. BH Ma1, 4. BHB Ma2, 5. HKMa2, 6. ĐA Mw, 7. HK Mw2 , 8. HK Mw1, 9. CN Mb1, 10. HK Mb1
Bảng 2.2. Công thức môi trường Z8 (theo Kotail, 1971) [43]
Dung dịch Hóa chất Khối lượng (g/100mL)
Dung dịch Stock I
MgSO4 2,5
NaNO3 16,7
Ca(NO3)2.4H2O 5,9 Dung dịch Stock II K2HPO4.3H2O 4,1
Na2CO3 2,1
Dung dịch Stock III FeCl3 2,8
EDTA 3,9 Na2WO4.2H2O 0,33 (NH4)6Mo7O24.H2O 0,88 KBr 1,2 7 8 5 6 4 2 1 3 9 1 0
KI 0,83 ZnSO4.7H2O 2,87 Cd(NO3)2.4H2O 1,55 Co(NO3)2.6H2O 1,46 CuSO4.5H2O 1,25 NiSO4(NH4)2SO4.6H2O 1,98 Cr(NO3)3.9H2O 0,41 V2O5 0,089 KAl(SO4)2.12H2O 4,74 H3BO3 3,1
Cách pha môi trường Z8:
- Stock I (100mL) = 1mL MgSO4. 3H2O + 1mL NaNO3 + 1mL Ca(NO3)2.4H2O + 97 mL nước cất.
- Stock II (100mL) = 1mL K2HPO4.3H2O + 1mL + 98 mL nước cất. - Stock III (100mL) = 1mL FeCl3 + 1mL EDTA + 98mL nước cất.. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Vi lượng Z8: Các dung dịch V2O5 và H3BO3 lấy 10mL, các dung dịch còn lại lấy 1mL rồi bổ sung nước cất cho đủ 1L.
Môi trường Z8 (1L) = 10mL Stock I + 10mL Stock II + 10ml Stock III + 1mL dung dịch vi lượng + 969mL nước cất.
Môi trường được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút.
Nhiệt độ phòng nuôi 22 - 25oC, ánh sáng đèn huỳnh quang 1500 – 2000 lux,
pH 7,2 [88 ].
2.2.2. Các phương pháp xác định điều kiện môi trường nuôi cấy
Nhiệt độ được điều chỉnh bằng máy điều hòa nhiệt độ Toshiba – Nhật Bản pH được đo bằng máy Sension 3 – Hach – Mỹ
Cường độ ánh sáng được đo bằng Lux kế HI 97500 luxmeter – HANNA - Italy.
2.2.3. Phương pháp nhân sinh khối
Nhân giống cấp 1 với thể tích môi trường 200 mL trong bình kín dung tích 500 mL. Sau 7 ngày, sử dụng giống cấp 1 để nhân giống cấp 2 trong thùng xốp dung tích 20 L với thể tích môi trường 15 L. Mật độ ban đầu giống nhau là 4.104 tế bào/mL. Thực hiện khuấy đảo hằng ngày. Khi tảo sinh trưởng cực đại, tiến hành thu sinh khối và chiết lipid.
Trong quá trình nhân sinh khối, kiểm tra sự tạp nhiễm của giống trước khi tiến hành nhân giống và trước khi thu sinh khối bằng cách quan sát mẫu dưới kính
hiển vi.
2.2.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Số lượng tế bào vi khuẩn lam trong một thể tích nước được xác định bằng cách sử dụng buồng đếm Sedgewick Rafter có dung tích 1mL với 1000 ô đếm. Mẫu được đếm dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại x 100.
Đếm 5 ô ( 4 góc 4 ô và 1 ô ở giữa) của buồng đếm. Tính số tế bào trung bình của mỗi ô.
Nếu a là số lượng tế bào vi khuẩn lam trung bình của mỗi ô thì số lượng tế bào (X) trong 1mL là: X = a x 1000 (tế bào)
2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng lipid
Sử dụng phương pháp Soxhlet để tách chiết lipid. Đây là phương pháp tách chiết lipid hiệu quả nhất theo Gutierrez-Wing [30].
Tiến hành thu sinh khối vi khuẩn lam bằng phương pháp để lắng và li tâm với tốc độ 8500 vòng/ phút trong 5 phút [103]. Cho mẫu thu được vào giấy lọc (đã được sấy khô và xác định trọng lượng, tối thiểu 1g), sấy ở nhiệt độ 65oC đến khối lượng không đổi. Sau đó đặt túi giấy lọc có chứa mẫu vào hệ thống Soxhlet, cho vào dung môi methanol: chloroform với tỉ lệ 1: 2. Đặt hệ thống chiết lên bếp cách thuỷ và chiết. Đến khi trích ly hoàn toàn lipid, tiến hành thu mẫu, sấy khô và xác định trọng lượng [33].
Hàm lượng lipid tổng số được tính theo công thức: X =
Trong đó: X : hàm lượng lipid tổng số ( %).
a : trọng lượng giấy lọc và mẫu trước khi chiết (g). b : trọng lượng giấy lọc và mẫu sau khi chiết (g).
c : trọng lượng mẫu lấy để phân tích lipid (g).
2.2.6. Bố trí thí nghiệm
2.2.6.1. Xây dựng đường cong sinh trưởng của các chủng nghiên cứu
Tiến hành nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam trên môi trường Z8 trong bình tam giác dung tích 250 mL. Mỗi bình cho vào 100 mL môi trường. Cấy giống vào môi trường với mật độ tế bào ban đầu giống nhau là 4.104 tế bào/mL. Xác định mật độ tế bào sau 2, 4, 6... ngày nuôi cấy để xây dựng đường cong sinh trưởng.
2.2.6.2. Thăm dò hàm lượng lipid của các chủng vi khuẩn lam
Sử dụng môi trường Z8, chiếu sáng với chu kì 12h sáng: 12h tối.
Nhân giống cấp 1 trong chai thủy tinh dung tích 500 mL, mỗi chai cho vào 200 mL môi trường Z8, hấp khử trùng môi trường. Cấy giống vào môi trường với mật độ ban đầu là 4.104 tế bào/mL, thao tác trong tủ cấy vô trùng.
Nhân giống cấp 2 trong thùng xốp dung tích 20 mL. Chuẩn bị môi trường trong chai thủy tinh dung tích 500 mL để hấp khử trùng môi trường. Sau đó chuyển môi trường đã được khử trùng qua thùng xốp để nhân giống cấp 2, mật độ ban đầu là 4.104 tế bào/mL, thao tác trong phòng nuôi vô trùng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.6.3. Khảo sát sự sinh trưởng của một số chủng vi khuẩn lam trong các điều kiện môi trường khác nhau kiện môi trường khác nhau
Tuyển chọn 4 chủng vi khuẩn lam có hàm lượng lipid cao. Tiến hành khảo sát sự sinh trưởng trong bình tam giác dung tích 250 mL, mỗi bình chứa 100 mL môi trường. Mỗi chủng chuẩn bị hai lô thí nghiệm với 4 công thức môi trường Z8 thiếu dinh dưỡng:
- Môi trường thiếu 50% nitrogen ((-)50% N): sử dụng NaNO3 8,35g/100mL, Ca(NO3)2 2,5g/100mL trong Stock I
- Môi trường thiếu 100% nitrogen ((-)100% N): loại NaNO3 và Ca(NO3) khỏi Stock I
- Môi trường thiếu 50% nitrogen và 50% phosphorus ((-)50% N (-)50% P): sử dụng NaNO3 8,35g/100mL, Ca(NO3)2 2,5g/100mL trong Stock I, K2HPO4 2,05g/100mL trong Stock II.
- Môi trường thiếu 50% phosphorus ((-)50% P): sử dụng K2HPO4 2,05g/100mL trong Stock II
Một lô bố trí dưới điều kiện chiếu sáng 12h sáng: 12h tối (12h:12h), còn lô kia bố trí dưới điều kiện chiếu sáng 7 ngày sáng: 7 ngày tối (7d:7d).
Tiến hành xác định mật độ tế bào sau 2, 4, 6, … ngày nuôi cấy.
2.2.6.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng và chiếu sáng lên hàm lượng lipid của một số chủng vi khuẩn lam lượng lipid của một số chủng vi khuẩn lam
Nhân giống cấp 1 của mỗi chủng nghiên cứu trong chai thủy tinh với 200mL môi trường.
Nhân giống cấp 2 trong các thùng xốp: Mỗi chủng chuẩn bị môi trường thí nghiệm giống mục 2.2.6.3 nhưng được đựng trong chai thủy tinh 500mL để hấp khử trùng môi trường. Sau đó chuyển môi trường đã được hấp khử trùng vào các thùng
xốp để nhân giống cấp 2. Nuôi cấy trong thời gian 14 ngày, tiến hành thu sinh khối và chiết lipid. Bố trí các công thức thí nghiệm theo bảng 2.3.
Bảng 2.3. Bố trí công thức thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng và chiếu sáng đến hàm lượng lipid
Điều kiện chiếu sáng Điều kiện dinh dưỡng Tên công thức thí nghiệm
12h: 12h (-) 50% N I (-) 100% N II (-) 50% N, (-) 50% P III (-) 50% P IV 7 d: 7d (-) 50% N V (-) 100% N VI (-) 50% N, (-) 50% P VII (-) 50% P VIII 2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần
Sử dụng chương trình Microsoft Excel và SPSS.
CHƯƠNG 3