Hoạt tính sinh học của các phức chất nói chung được phát hiện từ đầu thế kỷ XIX. Phức chất của các aminoaxit được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp và y học. Trên thế giới, ở nhiều nước như Anh, Mỹ, Liên Xô cũ đã sử dụng phức chất dạng vòng càng của các kim loại sinh học vào ngành trồng trọt, nhằm làm tăng năng suất của mùa màng, chống bệnh vàng lá, rụng quả xanh,...
Trong y học, các viên thuốc chứa lượng rất nhỏ các NTĐH đã được phát hiện và thử nghiệm trên thực tế lâm sàng. Phức của axit aspactic với các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
NTĐH hóa trị III và kẽm có tính chất làm giảm hàm lượng đường trong máu và nước tiểu. Sự hấp thụ và trao đổi chất của một vài α - aminoaxit có liên quan đến tế bào ung thư của cơ thể.
Ngày nay vấn đề nghiên cứu tìm kiếm và tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học ít độc, có tác dụng chọn lọc cao đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong luận văn này chúng tôi tiến hành bước đầu thăm dò hoạt tính sinh học trên một số loại vi khuẩn E.coli, Salmonella,
Shigella, Staphylococcus aureus.
1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu sự tạo phức trong dung dịch
Có nhiều phương pháp hoá lý khác nhau để nghiên cứu sự tạo phức trong dung dịch như: phương pháp quang phổ,chuẩn độ đo pH, chuẩn độ điện thế, cực phổ, độ tan…
Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu sự tạo phức của ion đất hiếm (La3+, Ce3+, Pr3+, Nd3+, Sm3+, Eu3+, Gd3+) với L-Asparagin bằng phương pháp chuẩn độ đo pH, vì phương pháp này có ưu điểm là thiết bị đơn giản, nồng độ dung dịch nghiên cứu không cần lớn, có thể sử dụng đối với các phức chất có mầu hoặc không có mầu, các kết quả thực nghiệm thu được thuận tiện cho việc tính toán hằng số bền.
1.5.1. Phương pháp chuẩn độ đo pH
Cơ sở của phương pháp này là khi tạo phức giữa ion kim loại với phối tử có sự giải phóng ion H+. Giả sử M là kim loại, HL là phối tử, phức tạo thành là bậc 1:
M + HL ML + H+ (bỏ qua sự cân bằng điện tích) Khi xác định nồng độ ion H+
, có thể xác định được mức độ tạo phức hay vị trí cân bằng, pH của dung dịch càng giảm thì sự tạo phức càng lớn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phối tử là axit yếu được chuẩn độ bằng bazơ mạnh, có mặt chất điện ly trơ ở nồng độ thích hợp để duy trì lực ion. Sau đó xây dựng đường cong chuẩn độ biểu diễn sự phụ thuộc pH vào a (a là số đương lượng bazơ kết hợp với một mol axit).
Tiến hành chuẩn độ dung dịch có thành phần tương tự, chỉ khác là có thêm ion đất hiếm và cũng xây dựng đường cong chuẩn độ như trên. Sự khác nhau giữa hai đường cong chuẩn độ cho biết có sự tạo phức xảy ra trong dung dịch.
Lực ion thường bằng 0,1 vì vậy cần lựa chọn nồng độ của ion kim loại và phối tử thích hợp để sự đóng góp các dạng điện tích của chúng cũng như dạng phức tích điện tạo thành vào lực ion tổng cộng không vượt quá 10 đến 12%. Để điều chỉnh lực ion người ta thường dùng các chất điện ly trơ như: KCl, KNO3. NaClO4,...
Công thức tính lực ion: I = 1 1 12 2 22 2
( ... )
2 C Z C Z C Zi i
Trong đó: I là lực ion.
Ci, Zi là nồng độ và điện tích của ion thứ i.
1.5.2. Phương pháp xác định hằng số bền của phức chất tạo thành
Phức thường được tạo thành từng bậc ứng với các phương trình sau: M + L ML
ML + L ML2 ... MLn-1 + L MLn Trong đó: M là ion trung tâm; L là phối tử
Các hằng số bền đặc trưng cho sự tạo thành phức chất ở các bậc khác nhau được xác định bằng các biểu thức:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn k1 = [ ] [ ][ ] ML M L ; k2 = 2 [ ] [ ][ ] ML ML L ;... ; kn = 1 [ ] [ ][ ] n n ML ML L Ký hiệu k là hằng số bền tổng cộng ta có: k = k1. k2...kn hay lg k = lg k1 + lg k2 +...+ lg kn
Để xác định hằng số bền của phức tạo thành, chúng tôi thực hiện theo phương pháp Bjerrum. Theo Bjerrum hằng số của phức tạo thành được xác định thông qua mối liên hệ giữa n và [L].
Trong đó: n là số phối tử trung bình hay còn gọi là hệ số trung bình các phối tử liên kết với một ion kim loại ở tất cả các dạng phức; [L] là nồng độ phối tử tại thời điểm cân bằng.
Việc xác định n và [L] dựa vào giá trị pH hay [H+] của dung dịch. Công thức tính toán và các số liệu thu được, chúng tôi trình bày ở phần thực nghiệm.
1.6. Các phƣơng pháp nghiên cứu phức rắn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.6.1. Phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại
Phương pháp này là một trong những phương pháp thông dụng để xác định có xảy ra hay không liên kết mới giữa các nhóm chức của phối tử với ion trung tâm, cấu tạo của phức, cũng như vai trò và mức độ thay đổi của phối tử khi nó tham gia phối trí. Khi tạo phức chất thì trong cầu phối trí của phức chất tồn tại một trường tĩnh điện mạnh gây ra bởi ion trung tâm và trường phối tử cũng tác dụng trực tiếp lên ion trung tâm. Tác động qua lại giữa các trương của ion trung tâm và phối tử làm thay đổi cấu hình hình học của cả ion trung tâm lẫn phối tử, làm thay đổi chiều dài, độ bền của một số liên kết cũng như gốc hoá của phối tử, dẫn tới các tiểu phân tham gia tạo thành phức chất có cấu hình khác với cấu hình của nó ở trạng thái tự do.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Khi phối tử tham gia vào cầu phối trí của phức thì phổ hấp thụ hồng ngoại của chúng bị thay đổi, sự thay đổi này có liên quan đến sự thay đổi kiểu liên kết giữa ion kim loại với phối tử. Để phát hiện được sự thay đổi đó người ta tiến hành so sánh phổ hấp thụ hồng ngoại của những hợp chất có chứa phối tử đó mà các dạng liên kết trong những hợp chất này đã được xác định rõ. Việc nghiên cứu phức chất bằng phương pháp này còn cho biết kiểu liên kết trong phức chất. Trong quá trình nghiên cứu phổ hồng ngoại của các chất, việc gán ghép các dải hấp thụ được thực hiện trên cơ sở tính toán các dao động chuẩn (đối xứng hoặc không đối xứng) của các nhóm nguyên tử. Để nhận biết các nhóm nguyên tử hoặc nhóm đặc trưng trong phân tử hoặc hợp chất cần nghiên cứu, chúng tôi tra bảng các tần số đặc trưng trong các tạp chí hoặc tài liệu nghiên cứu [12], [24].
Quang phổ hấp thụ hồng ngoại là phương pháp tin cậy cho khả năng phân biệt nhóm COOH phối trí hay không phối trí trong ion trung tâm. Nếu nhóm COOH tham gia vào cầu phối trí thì dao động hoá trị không đối xứng của nhóm C=O dịch chuyển về vùng có tần số thấp hơn.
1.6.2. Phương pháp phân tích nhiệt
Đây là phương pháp thuận lợi để nghiên cứu phức chất, áp dụng phương pháp này cho những kết quả về tính chất của các phức chất rắn. Phương pháp này dựa trên cơ sở khi đun nóng các hợp chất sẽ tạo ra các hiệu ứng nhiệt. Sử dụng các thiết bị máy móc để xác định khối lượng chất mất đi, xác định nhiệt độ mà tại đó xảy ra hiệu ứng nhiệt, người ta thu được các hiệu ứng đó qua giản đồ biểu thị sự biến đổi tính chất của chất nghiên cứu trong hệ tạo độ nhiệt độ và thời gian.
Giản đồ đó bao gồm các đường: Đường T, DTA, TGA
Trong đó: Đường T (thermogram) chỉ sự biến đổi đơn thuần nhiệt độ của mẫu theo thời gian.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đường DTA phân tích nhiệt vi phân (Differential thermal analysis) cũng chỉ sự biến đổi của nhiệt độ nhưng mẫu so sánh là mẫu chuẩn trong lò, đường này cho phép ta biết thời điểm xảy ra quá trình biến hoá xảy ra ở nhiệt độ nào, trên giản đồ cũng xác định rõ hiệu ứng thu nhiệt và hiệu ứng toả nhiệt. Đường TGA phân tích trọng lượng nhiệt (Thermogravimetry or Thermogravimetry analysis) xác định sự biến đổi trọng lượng mẫu nghiên cứu trong quá trình nâng nhiệt, có thể suy luận được thành phần của chất căn cứ vào độ giảm khối lượng khi xảy ra hiệu ứng nhiệt.
Phương pháp này còn có thể cho biết hợp chất có chứa nước phối trí hay nước kết tinh.
1.6.3. Phương pháp đo độ dẫn điện
Phương pháp này dựa trên cơ sở đo độ dẫn điện của các chất điện li được phân li hoàn toàn trong nước và ở trạng thái ion.
Phương pháp đo độ dẫn điện là một trong các phương pháp hoá lí nghiên cứu cấu tạo của phức chất. Độ dẫn điện của dung dịch được xác định bằng độ linh động của các ion tạo phức. Dựa vào độ dẫn điện có thể tìm được số lượng ion mà phức chất phân li ra.
Độ dẫn điện phụ thuộc vào các yếu tố sau: bản chất của ion trung tâm, bản chất của nhóm phối tử, cấu tạo của ion phức, dung lượng phối trí của các phối tử.
Khi nghiên cứu phức chất bằng phương pháp đo độ dẫn điện, người ta xác lập một số trị số trung bình của độ dẫn điện mol ( ) hoặc độ dẫn điện đương lượng () của dung dịch phức chất với một số ion do một phân tử phức chất phân li ra. Các giá trị này sẽ đặc trưng cho tính chất điện li của các phân tử phức chất trong dung dịch:
M C 1000 . (-1 .cm2.mol-1) (1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn N C 1000 . (-1 .cm2.dlg-1) (2) Trong đó: : Là độ dẫn điện riêng (-1
.cm-1) CM: Là nồng độ mol/l
CN: Là nồng độ đương lượng (dlg/l)
Khi áp dụng các định luật đặc trưng của chất điện li mạnh thông thường cho phức chất có sự tương ứng gần đúng là: cùng nồng độ dung dịch 10-3 mol/lit, khi phân li thành 2 ion có độ dẫn điện mol khoảng 100-1
.cm2.mol-1; khi phân li thành 3, 4 và 5 ion thì độ dẫn điện mol tương ứng là: 250, 400 và 500 (-1
.cm2.mol-1).
Dựa vào sự biến đổi độ dẫn điện có thể suy ra được độ bền của các phức chất có cùng kiểu cấu tạo. Việc nghiên cứu độ dẫn điện và biến đổi độ dẫn điện theo thời gian có thể cho biết tính chất phân li về tương tác của phức chất với dung môi. So sánh độ dẫn điện của hỗn hợp hai chất với độ dẫn điện của mỗi chất ở trạng thái riêng biệt, có thể biết được có sự tạo phức hay không. Nếu các chất không có tương tác với nhau thì độ dẫn điện của hỗn hợp của chúng trong dung dịch loãng bằng tổng số độ dẫn điện của các chất riêng rẽ. Còn nếu tạo thành phức bền thì độ dẫn điện của dung dịch được xác định bởi số lượng các ion tạo thành từ phân tử phức chất và bởi độ linh động của chúng.
1.7. Đối tƣợng thăm dò hoạt tính sinh học của phức chất: vi khuẩn
Salmonella, Shigella, E.coli, Staphylococcus aureus
Vi khuẩn (bacterium, bacteria) đôi khi còn được gọi là vi trùng, nó
thuộc loại ký sinh trùng. Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào và các bào quan như ty thể và lục lạp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Salmonella là loại trực khuẩn gram âm, có lông, có sức đề kháng tốt ở
ngoại cảnh. Trong đất sống được vài tháng, trong nước sống được vài tuần, trong thực phẩm đông lạnh được 2 - 3 tháng và sống cả ở những thực phẩm có nồng độ muối cao, ở 1000oC phải hơn 5 phút mới diệt được.
Shigella là trực khuẩn Gram âm, không di động. Đây là giống vi
khuẩn có tế bào chủ đặc biệt, chúng chỉ thích nghi và phát triển trong tế bào chủ là người và các loài linh trưởng. Chúng có thể tồn tại 6 tháng trong môi trường nước.
Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) là một loại khuẩn gam
âm được gọi là trực khuẩn (hình 1.1). Chúng sống kí sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Hầu hết các chủng khuẩn E.coli vô hại, vi khuẩn này cần thiết cho quá trình tiêu hoá thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Tuy nhiên một vài chủng khuẩn mới có thể gây bệnh đường tiêu hóa nặng. Gần đây, các nhà khoa học thuộc Đại học Nigata (Nhật Bản) đã xác định được một loại chủngvi khuẩn E.coli kháng thuốc, linh hoạt hơn vi khuẩn E.coli thông thường, có sức sống rất mạnh mẽ, có thể thay đổi hình dạng và bề mặt được bao phủ một lớp màng có thể chống lại sự tấn công của bạch huyết cầu
Staphylococcus aureus hay Tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn
Gram-dương kỵ khí tùy nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da. Khoảng 20% dân số loài người là vật mang lâu dài của S.aureus.Sắc tố carotenoid staphyloxanthin làm nên tính chất màu vàng của 'S.aureus', vốn có thể thấy được từ các khúm cấy trên thạch của vi khuẩn này. Sắc tố đóng vai trò là một tác nhân độc hại có tính chất chống oxy hóa giúp cho vi sinh vật không bị chết bởi các chủng oxy gây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
phản ứng được sử dụng bởi hệ thống miễn dịch. Các tụ cầu thiếu sắc tố sẽ dễ dàng bị tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể ký chủ.
Hình 1.3. Hình thái vi khuẩn Salmonella Hình 1.4. Hình thái vi khuẩn Shigella
Hình 1.5.Hình thái vi khuẩn E.coli Hình 1.6. Hình thái vi khuẩn S.aureus
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
2.1.1.1. Dung dịch đệm pH = 4,2 (CH3 COONH4, CH3COOH)
Lấy 3,99 ml CH3COOH 60,05% d = 1,05 g/ml hòa tan vào 150 ml nước cất hai lần trong bình định mức 250 ml. Lấy 0,5 ml NH3 25%, d = 0,88 g/ml hòa tan trong 40 ml nước cất hai lần rồi cho vào bình định mức trên,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thêm nước cất hai lần đến vạch định mức ta được dung dịch đệm pH = 4,2 (kiểm tra lại bằng máy đo pH).
2.1.1.2. Dung dịch asenazo (III) 0,1%
Cân một lượng chính xác asenazo (III) trên cân điện tử 4 số. Dùng nước cất hai lần hòa tan sơ bộ, nhỏ từng giọt Na2CO3 0,1% cho đến khi dung dịch có màu xanh tím. Đun nóng hỗn hợp ở 600C, tiếp theo nhỏ từng giọt axit HCl loãng cho đến khi dung dịch có màu tím đỏ và định mức đến thể tích cần thiết.
2.1.1.3. Dung dịch DTPA 10-3 M
Cân lượng chính xác DTPA (M = 393,35 g.mol-1) trên cân điện tử 4 số, hòa tan bằng nước cất hai lần, định mức đến thể tích cần thiết.
2.1.1.4. Dung dịch Ln(NO3)3 10-2 M (Ln: La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd)
Các dung dịch này được điều chế từ các oxit tương ứng như sau: cân chính xác một lượng oxit Ln2O3 theo tính toán trên cân điện tử 4 số, hòa tan bằng dung dịch HNO3 1M (được pha từ ống chuẩn). Cô cạn trên bếp cách thủy, sau đó hòa tan bằng nước cất hai lần và định mức đến thể tích xác định. Dùng phương pháp chuẩn độ complexon với chất chuẩn là DTPA 10-3
M, thuốc thử asenazo (III) 0,1%, đệm pH = 4,2 để xác định lại chính xác nồng độ ion đất hiếm.
2.1.1.5. Dung dịch L-Asparagin 10-2M.
Cân chính xác lượngL-Asparagin (M = 132,115 g.mol-1) cần dùng trên cân điện tử 4 số, sau đó hòa tan bằng nước cất hai lần, định mức đến thể tích cần thiết.
2.1.1.6. Dung dịch KOH 7,5.10-2 M