- Si O Si + (C H) SiNHSi(CH ) Si O Si + NH OH OH ( CH ) SiO OSi(CH )
Chương 3: SẮC KÍ LỎNG (LIQUID CHROMATOGRAPHY)
3.7.2 Nguyên tắc của SKLM
SKLM thường được tiến hành trên một bản thủy tinh có rải một lợp mỏng dính chắc của các hạt bột mịn. Lớp mỏng này thường được dùng làm pha tĩnh. Các pha tĩnh và động trong SKLM cũng tương tự các pha trong sắc kí lỏng hiệu năng cao
(sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố pha thuận và pha ngược, sắc kí trao đổi ion, sắc kí trên gel).
Chuẩn bị các lớp mỏng
Bột dùng để chế tạo lớp mỏng ( ví dụ bột silicagen) thường được thêm nước thành bột nhão và rải lên bề mặt sach của một tấm kính hay chất dẻo (hoặc phiến kính dùng để soi trên kính hiển vi) thành một lớp mỏng. Người ta thường cho thêm một chất kết dính (như bột bó) và bột nhão để giữ các hạt dính với nhau và dính trên mặt kính.
Tấm kính được để yên cho lớp mỏng định hình và dính vào mặt kính sau đó được đem sấy vài giờ trong tủ sấy.
Một số hãng hóa chất chế tạo sẵn nhiều loại bản mỏng như bản silicagen chỉ thị huỳnh quang dưới tia tử ngoại bước sóng 254 nm.
Khai triển sắc kí
Là quá trình cho pha động chạy xuyên qua pha tĩnh và kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha tĩnh.
Thường người ta chấm một giọt mẫu phân tích gần một mép của bản mỏng. Dùng bút chì đánh dấu nơi chấm mẫu.
Sau khi giọt mẫu đã khô, đặt bản mỏng vào bình sắc kí đã bão hòa hơi dung môi của pha động, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi pha động nhưng không được cho điểm chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động.
Sau khi dung môi chạy được nửa hay hai phần ba bản mỏng thì lấy ra sấy khô.
Có hai cách triển khai: o Sắc kí lên o Sắc kí ngang
Trên hình là sắc đồ hai chiều một số axit amin. Mẫu thử được chấm ở một góc của lớp mỏng (nơi đánh dấu x) cho dung môi A chạy, bay hơi dung môi , quay 90o cho dung môi B chạy, bay hơi dung môi, phun nihidrin là thuốc thử hiện màu của các axit amin. Xác định các chất bằng cách so sánh vị trí vết của mẫu với các vết của chuẩn.
Hình 33: Khai triển sắc kí theo hai chiều
Phát hiện các vết trên bản mỏng
Có nhiều phương pháp để phát hiện các vết:
Hai cách phổ biến có thể dùng để phát hiện hầu hết các chất hữu cơ là phun dung dịch iot hay axit sunfuric: sẽ xuất hiện các vết màu tối. Có thể phun các thuốc thử đặc hiệu (như ninhydrin). Cũng có thể thêm chất huỳnh quang vào pha tĩnh: cả bản mỏng sẽ sáng (huỳnh quang) khi soi đèn tử ngoại (ví dụ đèn có bức xạ 254 nm) nơi có chất phân tích thì sẽ tối hoặc có màu huỳnh quang khác với màu nền sáng của bản mỏng.
Có thể tóm tắt các phương pháp phát hiện như sau:
Nếu hợp chất có màu thì chỉ cần ánh sáng ban ngày.
Dùng tia tử ngoại UV cho những hợp chất phát được huỳnh quang (có các hệ nối đôi liên hợp)
Phun hơi iot cho những hợp chất chứa ít nhất một nối đôi.
DDùùnnggtthhuuốốcctthhửửDDrraaggeennddoorrffffđđểểddòòttììmmccááccaallkkaallooiidd. .
DDùùnnggtthhuuốốcctthhửửFFeeCCll33cchhooccáácchhợợppcchhấấtthhọọpphheennooll. .
DDùùnnggaanniilliinneepphhttaallaattđđểểpphháátthhiiệệnnccááccllooạạiiđđưườờnngg. .
DDùùnnggNNiinnhhyyddrriinnđđểểpphháátthhiiệệnnccáácchhợợppcchhấấttnniittrroonnhhưưaammiinn,,aammiinnooaaxxiitt. .
Phân tích bán định lượng
Có thể ước lượng (bán định lượng) lượng chất trên sắc đồ bằng cách so sánh diện tích vết của mẫu thử với diện tích của vết chuẩn.
Có thể thu được kết quả tốt hơn nếu cạo lấy bột chứa vết, chiết lấy chất phân tích và đem định lượng bằng một phương pháp lí hóa thích hợp.
Bài tập
Câu 3.1: Trình bày sự khác nhau cơ bản giữa sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố, sắc kí trao đổi ion
và sắc kí rây phân tử.
Câu 3.2: Giải thích tại sao lực rửa giải tăng lên khi dung môi pha động trở nên ít phân cực hơn
trong sắc kí pha đảo, trong khi đó lực rửa gải tăng lên khi dung môi pha động trở nên phân cực hơn trong sắc kí pha thuận.
Câu 3.3: Tại sao áp suất cao cần thiết trong sắc kí lỏng hiệu năng cao?
Pha liên kết trong sắc kí lỏng là gí? Cho biết một số pha lỏng liên kết không phân cực , phân cực trung bình và phân cực mạnh.
Câu 3.4: Trình bày nguyên tắc hoạt động của các loại detector được sử dụng trong HPLC:
a) Detector UV-VIS
b) Detector Photo diodArray c) Detector đo chỉ số khúc xạ d) Detector phát huỳnh quang
Câu 3.5: Cho biết các loại cấu tử nào có thể tách được bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao nhưng
không thể tách được bằng sắc kí khí.
Câu 3.6: Cho biết các bước cơ bản trong phát triển phép tách isocratic trong sắc kí pha đảo sử
dụng một dung môi hữu cơ và hai dung môi hữu cơ
Câu 3.7: Dự đoán trật tự rửa giải của các chất sau:
a) n-hexan, n-hexanol, benzene
b) ethyl axetate, diethyl ether, nitrobutane
Khi thực hiện phép tách là sắc kí pha thường và sắc kí pha đảo.
Câu 3.8: Các chất phân cực được tách ra bằng HPLC có cột tách chứa pha tĩnh phân cực
polyetylenglycol. Hỏi thời gian lưu của chúng thay đổi như thế nào nếu pha động gồm CH3CN/H2O có nồng độ acetonitril thay đổi từ 40 lên 60%.
Câu 3.9: Khi bạn cố gắng tách một hỗn hợp các chất chưa biết bằng sắc kí pha đảo với pha động
là 50% acetonil/50% nước thì thu được sắc kí đồ có các pic nằm quá gần nhau và đước rửa giải trong khoảng k’=2-6. Vậy trong lần chạy tiếp theo bạn nên tăng hay giảm thành phần acetonitril
Câu 3.10: Một hỗn hợp n-heptane, tetrahydrofuran, 2-butanone, và n-propanol rửa giải theo thứ
tự này ra khỏi cột pha tĩnh phân cực như Carbowax. Trật tự rủa giải sẽ đảo ngược theo đúng thứ tự trên nàu sử dụng cột pha đảo không phân cực như C18. Hãy giải thích trật tự rửa gải trong mỗi trường hợp.
Câu 3.11: Haddad và cộng sự đã báo cáo các hệ số dung lượng sau của một phép tách pha đảo
của
salicylamide (k sal) và caffeine (k caff).
%v/v methanol 30% 35% 40% 45% 50% 55%
k’sal 2.4 1.6 1.6 1.0 0.7 0.7
k’caff 4.3 2.8 2.3 1.4 1.1 0.9
Giải thích sự thay đổi sự thay đổi các giá trị k’ khi tăng nồng độ methanol trong pha động. Explain the changes in capacity factor. Có thuận lợi gì khi sử dụng pha động có % methanol thấp ? có bất lợi gì không?
Câu 3.12: Giả sử bạn cần tách một hỗn hợp benzoic acid, aspartame, và caffeine trong một nước giải khát soda. Các thông tin thu được như sau:
trkhi pha động được đệm ở pH bằng
Hợp chất 3.0 3.5 4.0 4.5
benzoic acid 7.4 7.0 6.9 4.4
aspartame 5.9 6.0 7.1 8.1
caffeine 3.6 3.7 4.1 4.4
(a) Giải thích sự thay đổi giá trị thời gian lưu cho mỗi hợp chất khi thay đổi pH pha động. (b) Giải thích thời gian lưu của 3 hợp chất khi pha đọng có cùng pH.
Câu 3.13: 2) Nồng độ của PAHs trong đất có thể được xác định bằng cách chiết PAHs bằng
methylene chloride. Dịch chiết sau đó được pha loãng, nếu cần thiết, và các PAHs được tách bằng HPLC sử dụng detector UV/Vis hoặc detector phát huỳnh quang. Trong một phép phân tích tiêu biểu, cân 2.013-g mẫu đất khô rồi chiết bằng 20.00 mL methylene chloride. Sau khi lọc đất, lấy 1-mL của phần dịch chiết pha loãng đến 10 mL bằng acetonitrile. Tiêm 5 µL của dịch chiết pha loãng này vào máy HPLC cho tín hiệu 0.217 (thứ nguyên tùy chọn) cho trường hợp fluoranthene. Khi tiêm 5 µL dung dịch chuẩn 20.0-ppm fluoranthene vào máy HPLC trong cùng điều kiện thì tín hiệu thu được là 0.258. Tinhd nồng độ ppm của fluoranthene trong mẫu đất trên.
Câu 3.14: Thành phần của một viên thuốc multivitamin được xác định bằng HPLC với diode array UV/Vis detector. Tiêm 5- L mẫu chuẩn có chứa 170 ppm vitamin C, 130 ppm niacin, 120 ppm niacinamide, 150 ppm pyridoxine, 60 ppm thiamine, 15 ppm folic acid, and 10 ppm
riboflavin vào máy HPLC, cho các tín hiệu lần lượt thoe thứ tự các chất trên (thứ nguyên tùy chọn), 0.22, 1.35, 0.90, 1.37, 0.82, 0.36, và 0.29.
Viên thuốc được chuẩn bị cho phân tích bằng cách ngiền mịn thành bột rồi chuyển vào bình tam giác cở 125-mL chứa 10 mL of 1% v/v NH3 trong dimethyl sulfoxide. Sau khi siêu âm trong 2 min, thêm vào 90 mL of 2% acetic acid, và hỗn hợ dung dịch được khuấy trong and 1 min và siêu âm ở 40 °C trong 5 min. Sau đó dịch được đem lọc với giấy lọc cỡ 0.45- m. Tiêm 5- L
mẫu vừa chuẩn bị trong máy HPLC trong cùng điều kiện cho các tín hiệu lần lượt là 0.87 cho vitamin C, 0.00 cho niacin, 1.40 cho niacinamide, 0.22 cho pyridoxine, 0.19 cho thiamine, 0.11 cho folic acid, và 0.44 cho riboflavin. Tính số milligrams của mỗi chất có trong viên vitamin.
Câu 3.15: . Lượng caffeine trong một viên thuốc giamr đau được xác định bằng HPLC sử dụng phương pháp lập đường chuẩn. Các dung dịch chuẩn caffeine được chuẩn bị và phân tích sử dụng vồng tiêm mẫu có thể tích 10- L. Kết quả đo các chuẩn như sau
Nồng độ các chuẩn Tín hiệu (ppm) (thứ nguyên tùy chọn) 50.0 8354 100.0 16925 150.0 25218 200.0 33584 250.0 42002
Mẫu được chuẩn bị bằng cách cho một viên thuốc trong một cốc nhỏ và thêm vào 10 mL
methanol. Sau khi mẫu hòa tan chuyển toàn bộ phần dịch cả phần không tan trong cốc vào bình định mức 25-mL và thêm methanol đến vạch. Mẫu sau đó được đem lọc, lấy 1.00-mL phần lọc cho vào bình định mức 10-mL rồi thêm methanol đến vạch. Khi phân tích bằng HPLC, tín hiệu thu được là 21469. Tính số milligrams caffeine trong viên thuốc giảm đau.