- Si O Si + (C H) SiNHSi(CH ) Si O Si + NH OH OH ( CH ) SiO OSi(CH )
Chương 3: SẮC KÍ LỎNG (LIQUID CHROMATOGRAPHY)
3.5. Phát triển một phép tách
Khi phát triển một phép tách, một chiến lược của việc chọn pha động đã được đề cập. Tuy nhiên khi phân tử có phần phân cực và một phần không phân cực thì những mục tiêu hỗ trợ chiến lược phát triển phương pháp hơi khác với những thảo luận trên.
Để minh họa cho việc tiếp cận phát triển phương pháp cho loại mẫu này, ba loại estrogen trong một mẫu dược phẩm sẽ được tách. Cấu trúc của ba loại này trong hình 3.9.
Hình 3.9: Cấu trúc của 3 estrogen liên hợp
Hình 3.10: Kết quả tách cuối cùng của 3 estrogen (a) Mẫu chuẩn, (b) Mẫu viên thuốc. Pha động sử dụng 35/65 MeOH/H2O(v/v) + đệm KH2PO4 0.001M
Trong ví dụ này trong khi tất cả các hợp chất có cấu tạo tương tự nhau về mặt cấu trúc, chúng chỉ khác về mức độ bão hòa trong vòng thứ hai, điều này ngụ ý về sự khác nhau của phần không phân cực trong các phân tử này. Các phân tử này là những muối natri và có điện tích -1 khi hòa tan trong nước.
Sử dụng cột trao đổi ion có lẽ không là một ý tưởng tốt vì tất cả các hợp chất này đều có cùng điện tích và không may pKa của chúng không được biết.
Bởi vì có sự khác biệt nhau về cấu trúc phần không phân cực trong phân tử, ta nên chọn pha tĩnh mà có thể phân biệt đối xử giữa sự khác nhau của những phần không phân cực này (nếu pKa của chúng khác nhau đáng kể thì có thể tiếp cận phương pháp sắc kí trao đổi ion). Một pha liên kết không phân cực như C18 là một lựa chọn thích hợp. Trong nhiều trường hợp, việc có sẵn nhiều loại cột không phân cực sẽ quyết định loại cột nào được chọn cho phép tách. Tuy nhiên, như đã được đề cập trước đây, bởi vì cột C18 cho sự lưu giữ tốt với một khoảng rộng của lực rửa giải của pha động, nó là cột dùng cho những mục đích phổ biến tốt nhất cho pha đảo.
Sau khi cột C18 được chọn, nhưng dung môi mạnh và yếu phải được chọn. Bởi vì cột không phân cực được chọn nên nước được chọn như là dung môi yếu còn metanol như là dung môi mạnh. Tuy nhiên, acetonitril hoặc THF có lẽ cũng có thể được chọn như là một dung môi mạnh. Lực dung môi theo trật tự sau : metanol < acetonitril < THF. Vì thế, chọn metanol trước sẽ cho phép uyển chuyển trong việc chọn hai dung môi sau nếu metalnol không cho kết quả tách tốt. Ngoài ra metanol được xem là dung môi ít độc hơn so với hai dung môi kia.
Bởi vì điểm bắt đầu là một cột pha liên kết C18 10 µm và một pha động gồm
metanol/nước, cần chuẩn bị một mẫu chứa 3 chất chuẩn trong một hỗn hợp 50:50 metanol/nước. Đây là một sự lựa chọn tùy ý vì thành phần pha động chưa được xác định. Dung dịch mẫu cũng được hòa tan trong cùng một dung môi như trường hợp dung dịch chất chuẩn, được trộn trong thời gian ngắn và được lọc để tách những chất không hòa tan trong viên thuốc.
Bước tiếp theo là bắt đầu chạy sắc ký với 100 % metanol như là pha động với tốc độ pha động thích hợp. Metanol được kiểm tra như là một dung môi mạnh bởi việc quan sát sau khi tiêm mẫu, tất cả đều được hòa tan tại thể tích chết vì thế không có sự tách ở đây. Như vậy metanol là dung môi quá mạnh làm cho các cấu tử cần tách trong mẫu đều hòa tan vào trong pha động và không bị lưu giữ trên pha tĩnh. Chất rửa giải này phải được làm yếu hơn nhờ thêm vào nó phần trăm đã biết của nước và mẫu được tiêm vào. Qúa trình này được tiếp tục cho đến khi sự lưu giữ bắt đầu rõ ràng. Trong ví dụ này đó là trường hợp 50:50 metanol/nước và kết quả tách tốt nhất tại 35:65 metanol/nước. Bước tiếp theo là tiêm các chuẩn của estrogen và xác định lại sự lưu giữ của chúng.