1.3. PH ƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN
1.3.3. Cơ chế biến nạp T–DNA vào tế bào ký chủ
Để xảy ra quá trình biến nạp tế bào thực vật phải bị thương. Vì lúc này tế bào thực vật tiết ra các hợp chất làm tín hiệu cảm ứng cho vi khuẩn tấn công và xâm nhập. Các hợp chất cảm ứng được chia làm hai loại:
- Các monocharide: tạo ra sự hấp dẫn trên một quãng đường dài đối với những chủng vi khuẩn Agrobacterium độc và không độc đến vị trí vết thương ở rễ.
- Dạng tiền phenol và các chất trung gian của sự sinh tổng hợp lignin có vai trò rất đặc biệt. Ở nồng độ thấp (<10P-7PM đối với acetosyringone) các phenolic này hoạt động như chất lôi kéo chuyên biệt chỉ đối với chủng Agrobacterium độc. Sản phẩm của virA và virG làm trung gian cho sự lôi kéo theo các hóa chất này. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn thì các hợp chất phenolic cùng loại này có vai trò những chất cảm ứng chuyên biệt sự điều hòa gen vir thông qua dấu hiệu kép (virA và G) của cơ chế tải nạp tương tự với các hệ thống điều hòa của các loài vi khuẩn khác. [18]
Một tiến bộ trong phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium là hoạt chất acetosyringone hỗ trợ cho quá trình chuyển gen.
Hình 1.5. Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen Acetosyringone (tên hóa học: 1-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) ethanol), công thức phân tử là CR10RHR12R0R4R, có tác dụng kích thích quá trình biến nạp gen của A.
tumefaciens vào tế bào mô vì acetosyringone là hợp chất được sản sinh khi tế bào bị tổn thương. Đây là tín hiệu quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào thực vật. Ở nồng độ cao, acetosyringone sẽ được nhận diện bởi protein virA- receptor trên màng vi khuẩn. Đây là một protein cần thiết để chuyển phân tử tín hiệu acetosyringone từ vị trí kế bên mô cây bị tổn thương, xuyên qua màng tế bào, vào tế bào của A. tumefaciens. Sau khi vào tế bào của A. tumefaciens, acetosyringone hoạt động như một nhân tố có tính chất hoạt hóa virA hỗ trợ với virG-protein để kích thích sự thể hiện virB, virC, virD, virE. Sự thể hiện các gen này cần thiết cho việc cắt T-DNA ra khỏi Ti plasmid và đưa nó vào tế bào thực vật.
Nhờ hoạt chất acetosyringone mà hiệu suất chuyển gen cao gấp nhiều lần.
Theo Sheikholeslam SN. (1987) đã ghi nhận với việc bổ sung acetorycinone tăng hiệu suất chuyển gen là 55 đến 63% thay vì bình thường là 2-3%. [111]
* Quá trình biến nạp T–DNA vào tế bào ký chủ được tóm tắt như sau:
(1) Vi khuẩn nhận ra và tấn công vào tế bào ký chủ.
(2) Các hợp chất cảm ứng của tế bào ký chủ tiết ra cảm ứng với sản phẩm của hệ thống tín hiệu kép (vir A và G).
(3) Vùng gen vir được hoạt hóa.
(4) Bản sao của T–DNA được tạo ra dưới sự có mặt phức hợp protein của vir D1, D2.
(5) Bản sao này kết hợp với protein của vir D2, tạo thành phức hợp T–DNA protein và với một số protein của các vir khác đi vào tế bào chất của tế bào ký chủ thông qua kênh vir B/D4T4SS.
(6) Phức hợp này lại kết hợp với sản phẩm của vir E, rồi đi vào tế bào chất của tế bào ký chủ. Protein của vir D2 và sản phẩm của vir E gắn với bản sao T–DNA có tác dụng bảo vệ sợi T–DNA không bị phân cắt bởi các enzyme exonuclease.
(7) Phức hợp T–DNA protein đi vào nhân tế bào ký chủ.
(8) Khi đã vào trong nhân, T–DNA xác định điểm để xen vào.
(9) T–DNA tách ra khỏi các protein bảo vệ.
(10) T–DNA gắn vào bộ gen của tế bào ký chủ một cách ngẫu nhiên.
Hình 1.6. Trình tự biến nạp T-DNA vào tế bào ký chủ.
(http://www.egohabitat.com)
1.3.4. Ứng dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trong chuyển gen thực vật Trên thực tế, A. tumefaciens chỉ gây hại ở cây hai lá mầm. Gần đây, nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens, các cây một lá mầm cũng có thể sản xuất opine và có thể khai thác việc chuyển gen của A. tumefaciens ở cây một lá mầm.
Mặc dù Ti–plasmid của A. tumefaciens là vectơ tự nhiên nhưng chúng lại có nhược điểm so với vectơ nhân dòng:
- Sự sản xuất phytohormon của tế bào thực vật chuyển gen (được nuôi cấy trong môi trường) ngăn cản chúng tái sinh thành cây trưởng thành hoàn chỉnh và khỏe mạnh. Do đó, gen mã hóa cho enzyme tham gia tổng hợp auxin và cytokinin cần phải được loại bỏ khỏi Ti–plasmid.
- Gen mã hóa các enzyme tham gia tổng hợp opine không có vai trò đối với kỹ thuật tạo thực vật chuyển gen. Do đó, các gen này phải loại bỏ khỏi plasmid.
- Ti–plasmid có kích thước lớn (200 – 800 kb) gây khó khăn trong quá trình thao tác tạo DNA tái tổ hợp. Vì vậy, các đoạn DNA không cần thiết cho quá trình tạo dòng và biểu hiện gen cần được loại bỏ.
- Ti–plasmid không sao chép trong E. coli nên việc nhân dòng plasmid tái tổ hợp trong E. coli không thể thực hiện được. Do đó, khi xây dựng vectơ plasmid phải thêm đoạn ori của plasmid E. coli để có thể sao chép trong tế bào E. coli. [38]
Để khắc phục những nhược điểm, trên các nhà khoa học đã tạo ra vectơ tái tổ hợp dựa trên nguyên tắc của Ti–plasmid. Vectơ này gồm có các thành phần sau:
- Các gen chọn lọc như: neomycin phosphotransferase, gen tạo khả năng kháng kanamycin, kháng hygromycin của tế bào thực vật chuyển gen…
- Trình tự ori cần thiết cho sự sao chép và nhân đôi của plasmid trong E. coli.
- Trình tự vai phải của vùng T–DNA: vùng này tuyệt đối cần thiết cho quá trình chuyển gen xảy ra. Một số vectơ có thể có trình tự cả hai vai. [40]
- Vùng polylinker (multiple cloning site) để thuận tiện cho việc cắt và chèn gen vào plasmid.