1.5. GEN IPT (ISOPENTENYL TRANSFERASE)
1.5.2. Cơ chế tác dụng của gen ipt
Chất điều hòa sinh trưởng cytokinin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý ở thực vật (Mok Mok, 2001; Riefler et al., 2006). Sự biểu hiện của gen ipt trong thực vật chuyển gen đưa đến sự gia tăng hàm lượng cytokinin nội sinh. [35], [61], [95]
Enzyme isopentenyl transferase do gen ipt mã hóa sẽ tham gia thủy giải bước đầu tiên trên con đường sinh tổng hợp cytokinin, thêm nhóm isopentenyl pyrophosphate đến N6 của 5’-AMP để hình thành isopentenyl AMP. [45]
3THình 1.8. Sơ đồ tạo cytokinin trong thực vật dưới tác dụng của gen ipt
3T(iPMP: isopentenyladenosine 5’-monophosphate, AMP: adenosine 5’- monophosphate, DMAPP: dimethylallylpyrophosphate, ipt: isopentenyl transferase, iPA: isopentenyladenosine, ZR: zeatin riboside, ZMP: zeatin monophosphate).
3T1.6. NUÔI CẤY TẾ BÀO – SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP
3T1.6.1. 0T3THợp chất thứ cấp và nuôi cấy mô, tế bào
Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp được sinh tổng hợp từ sản phẩm trao đổi chất sơ cấp, phân bố hạn chế ở một số loài trong giới thực vật. Mặc dù không có vai trò đáng kể trong chuyển hóa cơ bản (con đường chuyển hóa chính của thực vật) do không phải là chất dinh dưỡng, không trực tiếp cần thiết cho sự phát triển của thực vật, nhưng sản phẩm chuyển hóa thứ cấp có ý nghĩa sinh thái quan trọng, giúp thực vật tương tác với môi trường và sống sót trước áp lực chọn lọc của môi trường. [39]
Con đường phụ thuộc iAMP
iPMP/[2H6]iPMP iPA/[2H6]iPA [2H6]PA
hydroxylase AMP + DMAPP ipt
hydroxylase
(Crister Astot và cs., 2000) [2H5]ZMP/ZMP [2H5]ZR/ZR AMP + tiền chất
chuỗi bên
2H2O
Con đường độc lập iAMP
ipt
Những nghiên cứu về hợp chất thứ cấp thực vật phát triển từ những năm 1950.
Có khoảng 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống. Những hợp chất như các alkaloid, terpenoid, saponin… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Các hợp chất thứ cấp thường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào đặc biệt (tế bào rễ tơ, biểu mô, hoa, lá…) và trong những giai đoạn phát triển nhất định, thường trong điều kiện đáp ứng với stress môi trường.
[31], [39]
Có nhiều khó khăn trong việc thu nhận một lượng lớn các hợp chất tự nhiên từ thực vật. Đồng thời, nguồn tài nguyên thực vật ngày càng bị thu hẹp, nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng, dẫn đến khó khăn trong việc sử dụng các sản phẩm từ thực vật. Do đó, cần thiết phải có một phương thức sản xuất khác để cung cấp các sản phẩm này. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có tiềm năng to lớn cho ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Năm 1959, báo cáo đầu tiên về nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn đã được công bố bởi Tulecke và Nickell (Mỹ).
Trong số các sản phẩm thứ cấp có nguồn gốc từ tế bào thực vật, các hoạt chất rất có giá trị như shikonin, ginsenosid và berberin đã được sản xuất trên quy mô lớn, và đây thực sự là những thành công rực rỡ trong công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật.
[27], [31], [39]
0T1.6.2.0T0TQuy trình nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất thứ cấp
Quy trình nuôi cấy tế bào để chiết xuất hợp chất thứ cấp thường qua ba bước cơ bản: [31]
Nuôi cấy bioreactor Nuôi cấy callus
Nuôi cấy dịch huyền phù
Khi đã có callus, tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi trường thạch mềm rồi được cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động bằng cách lắc hoặc khuấy (nuôi cấy dịch huyền phù). Đây là giai đoạn rất quan trọng, nghiên cứu khảo sát được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và có hàm lượng hoạt chất cao nhất có tính chất quyết định thành công của quá trình nuôi cấy tế bào. [31]
Khi tìm được điều kiện thích hợp, các nhà khoa học có thể phát triển quy mô nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy sinh học- bioreactor có dung tích khác nhau.
Sau khi nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm, tiếp tục triển khai các phòng sinh khối tế bào thực vật. Từ đó sử dụng các kỹ thuật chiết tách để thu nhận các hợp chất cần thiết. [41], [54], [76], [123]
* Thuận lợi của việc sản xuất sản phẩm chuyển hóa thứ cấp bằng nuôi cấy mô, tế bào thực vật: [97]
- Điều kiện nuôi cấy (hóa hoạc và vật lý) có thể được kiểm soát và tối ưu hóa cho việc sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.
- Tế bào có thể được chọn lọc và cải thiện bằng cách nhân dòng, gây đột biến hoặc biệt hóa bằng phương pháp hóa học hoặc phương pháp sinh học (kỹ thuật gen).
- Với những hệ thống đã biết có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa các chất trong tế bào và cơ chế sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứu cấp.