Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen

3.2. THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN

3.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen

Hygromycin có tính độc đối với tế bào thực vật lẫn tế bào động vật. Gen hpt mã hóa enzyme hygromycin phosphotransferase có khả năng phosphoryl hóa hygromycin, làm mất hoạt tính của kháng sinh này. Do đó những tế bào được chuyển gen hpt sẽ phát triển bình thường trong môi trường có hygromycin với nồng độ thích hợp.

Nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp sẽ được sử dụng để chọn lọc các dòng mô sẹo sau thí nghiệm xử lý chuyển gen. Tùy đối tượng mà hygromycin tác dụng chọn lọc với các nồng độ khác nhau, nếu nồng độ tác nhân này trong môi trường chọn lọc quá thấp thì kết quả chọn lọc không đáng tin cậy, nhưng nếu nồng độ quá cao sẽ làm chết cả các tế bào đã được chuyển gen.

Tiến hành nuôi cấy các mẫu mô sẹo trên môi trường S2 bổ sung hygromycin ở các nồng độ khác nhau (0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40 mg/l). Sau 2 tuần, các mẫu thí nghiệm có biểu hiện tăng trưởng chậm và bắt đầu chuyển sang nâu hơn so với mẫu đối chứng (0 mg/l), đặc biệt là các mẫu thí nghiệm với nồng độ hygromycin cao (> 20 mg/l). Tiếp tục cấy chuyển và theo dõi sau 8 tuần, kết quả cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm ở nồng độ hygromycin ≥ 25 mg/l trở nên nâu và chết; còn đối với các mẫu thí nghiệm ở nồng độ hygromycin thấp hơn 25 mg/l, sau thời gian đầu tăng trưởng chậm có sự hình thành các cụm tế bào mới bắt đầu tăng sinh lại.

Bảng 3.3.Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin Môi trường S2 có bổ

sung hygromycin (mg/l)

Số mẫu sống

Sau 2 tuần Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần

0 mg/l hygromycin 15 15 15 15

5 mg/l hygromycin 15 14 14 14

10 mg/l hygromycin 13 11 9 9

15 mg/l hygromycin 12 10 8 7

20 mg/l hygromycin 11 7 5 4

25 mg/l hygromycin 8 6 3 0

30 mg/l hygromycin 5 3 1 0

35 mg/l hygromycin 5 2 0 0

40 mg/l hygromycin 3 1 0 0

Một số nghiên cứu môi trường chọn lọc sau chuyển gen đối với các loài thuộc chi Panax thường sử dụng chất kháng sinh kanamycin hoặc hygromycin.

Nồng độ kanamycin được sử dụng ở các loài này là 50 mg/l (Ananchanok Tirajoh et al., 1996), hygromycin với nồng độ chọn lọc khoảng 20 mg/l hoặc cao hơn. Tuy nhiên trong thí nghiệm này, nhận thấy ở nồng độ hygromycin ở giới hạn 25 mg/l thì các mô sẹo đã ngừng tăng trưởng và chết dần.

Như vậy, 25 mg/l được xem là nồng độ thích hợp cho sự chọn lọc mô sẹo sâm Ngọc Linh.

Hình 3.8. Kết quả thử hygromycin sau 8 tuần

3.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.2.2.1. Biến nạp plasmid vào E. coli; kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong E.

coli và tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dùng chuyển gen

Mục đích của các thí nghiệm này là tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dùng để chuyển gen.

Vật liệu ban đầu là plasmid pVDH396 mang gen ipt. Trước hết, plasmid này được biến nạp vào vi khuẩn E. coli. Sau biến nạp, vi khuẩn E. coli được nuôi nhân, tách chiết plasmid. Plasmid tách chiết được đem kiểm tra kích thước bằng cách

dùng enzyme NcoI để cắt và chạy điện di trên gel. Kết quả điện di cho thấy kích thước plasmid khoảng 15,9 kb (hình 3.9) - phù hợp với kích thước plasmid dùng biến nạp.

Tiếp theo, plasmid (tách từ E. coli) được biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Sản phẩm Agrobacterium tumefaciens biến nạp được nuôi cấy nhân dòng, tách chiết plasmid và thực hiện phản ứng PCR đối với gen ipt. Kết quả cho thấy có sự hiện diện của băng DNA khuếch đại với kích thước 615 bp (hình 3.10).

Như vậy, dòng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được đã chứa plasmid pVDH396 (mang gen đích ipt) và được sử dụng để chuyển gen vào mô sâm.

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid pVDH396 Dãy 1: thang DNA chuẩn λ-HindIII

Dãy 2: plasmid trong E. coli

1 1

1

2

15,9 kb

23,130 kb 9,416 kb

3.2.2.2. Gây nhiễm và nuôi chung mô với vi khuẩn; chọn lọc tế bào chuyển gen trên môi trường có hygromycin

Do lần đầu tiên triển khai thí nghiệm chuyển gen dùng hygromycin để chọn lọc nên việc tìm hiểu, đánh giá tính chịu đựng tự nhiên của mô sẹo đối với kháng sinh này là rất quan trọng. Kết quả thử nghiệm cho thấy mô sẹo sâm Ngọc Linh khá mẫn cảm đối với hygromycin. Trên môi trường S2 có 5 mg/l, mô sẹo tăng sinh tương đối bình thường. Ở nồng độ 10 mg/l, nhận thấy phần lớn mô sẹo còn khả năng tăng sinh nhưng chậm; ở nồng độ cao hơn, 20 mg/l, tăng trưởng của mô sẹo bị ức chế mạnh, chết rất nhiều và chết hoàn toàn ở nồng độ từ 25 mg/l trở lên. Theo Choi (2006), qua sử dụng mô sẹo có khả năng sinh phôi (embryogenic) sâm Triều Tiên để nghiên cứu biến nạp gen, nồng độ hygromycin thích hợp dùng chọn lọc tế bào dao động từ 10 – 30 mg/l; tuy nhiên, Shim và cs. (2010) dùng nồng độ hygromycin rất cao, 100 mg/l, qua sử dụng lá mầm (cotyledon) để nghiên cứu. Theo chúng tôi, sự khác nhau về nồng độ hygromycin sử dụng giữa hai tác giả nêu trên có

Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen ipt ở plasmid tách chiết từ vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được qua biến nạp

Dãy 1: thang DNA chuẩn 1 kb

Dãy 2: plasmid pVDH396 (đối chứng dương) Dãy 3: nước cất (đối chứng âm)

Dãy 4: plasmid pVDH396từ A. tumefaciens

500 bp 615 bp

4 3 2 1

thể do vật liệu dùng chuyển gen là khác nhau và môi trường nuôi cấy khác nhau.

Kết quả thử nghiệm đánh giá tác động của hygromycin trên sâm Ngọc Linh cho thấy khá tương hợp với kết quả nghiên cứu của Choi (2006) trên sâm Triều Tiên.

Thực tế cho thấy các cụm mô sẹo, sau nuôi chung với vi khuẩn, nếu được nuôi cấy chọn lọc ngay trên môi trường có 25 mg/l hygromycin thường không có khả năng sống; do vậy ở các bố trí thí nghiệm sau, nồng độ hygromycin sử dụng cho giai đoạn đầu là 15 mg/l. Sau đó tăng lên 25 mg/l ở các chu kỳ chọn lọc tiếp theo.

Trong quá trình chọn lọc, mô sẹo sống sót trên môi trường có 15 mg/l hygromycin được tách ra và cấy chuyển trải nuôi trên môi trường có nồng độ hygromcin đạt mức chọn lọc hiệu quả - 25 mg/l.

Theo Choi (2006), trong quá trình chọn lọc cần lưu ý sự tăng sinh của mô chuyển gen (transgenic) có thể bị ức chế bởi sự hóa nâu của mô chết. Thực tế ở nghiên cứu này cũng cho thấy hiện tượng tương tự; do vậy các mô sống sót nằm phía trên phần mô chết nâu đã được tách ra cẩn thận dưới kính hiển vi soi nổi và cấy chuyển sang môi trường mới.

Trên môi trường S2 có 25 mg/l hygromycin, có sự hình thành một số ít cụm mô trắng đục, có khả năng tăng sinh tiếp tục (hình 3.11c, 3.11d, 3.11e, 3.11f); chúng

Hình 3.11. Chọn lọc mô chuyển gen.

a. Mô sẹo dùng chuyển gen; b. Đĩa mô chọn lọc trên môi trường có hygromycin;

c, d. Mô sẹo hóa phôi sống sót và tăng sinh trên môi trường chọn lọc chứa 25 mg/l hygromycin; e, f. Hai loại kết cấu mô cứng (hóa phôi) và xốp hình thành trên môi trường chọn lọc chứa 25 mg/l hygromycin; g, h. Mô sẹo sống sót (2 dòng) tiếp tục được trải nuôi trên môi trường có hygromycin có 25 mg/l hygromycin

2 mm a 1 mm b c

d e f

g h

được tách và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc mới (cũng có 25 mg/l;

hygromycin) để tiếp tục tăng sinh (hình 3.11g, 3.11h).

Qua triển khai nghiên cứu, đến nay chúng tôi đã nhận được 04 dòng mô có khả năng tăng sinh trên môi trường có 25 mg/l hygromycin; tuy nhiên, kết cấu (texture) của mô khi chưa chuyển sang giai đoạn tái sinh có sự khác nhau về độ cứng (compact)/khả năng tạo cấu trúc phôi soma dạng cầu (hình 3.11e, 3.11f). Tần số chuyển gen đạt khoảng 0,5% (nhận được 04 dòng chuyển gen trên tổng số 800 cụm mô sẹo sử dụng để làm thí nghiệm).

3.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển

3.2.3.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA bằng kỹ thuật hóa mô

Khả năng phát hiện DNA ngoại lai đã được xen vào DNA bộ gen thực vật và từ đó có thể xác định các dòng tế bào đã biến nạp là điều hết sức quan trọng. Trong thí nghiệm này, một số dòng mô có khả năng tăng trưởng tương đối tốt trên môi trường có hygromycin đã được kiểm tra sự biểu hiện GUS.

Sau thời gian ngâm mẫu mô ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau trong dung dịch X-Gluc ở 37PoPC trong thời gian 12 giờ, thực hiện quan sát mô dưới kính hiển vi soi nổi. Kết quả cho thấy có sự biểu hiện GUS tạm thời (transient expression) của mô được ghi nhận ở giai đoạn 5 ngày sau khi nuôi chung - đang được nuôi trên môi trường chọn lọc có 15 mg/l hygromycin (Hình 3.12a). Biểu hiện GUS bền vững (stable expression) sau 1 tháng chọn lọc cũng đã được ghi nhận (Hình 3.12b). Sau nhiều tháng chọn lọc, mô các dòng sống sót trên môi trường có 25 mg/l hygromycin cũng được dùng để thử GUS; kết quả cho thấy có 02/05 dòng có biểu hiện GUS dương tính ổn định (Hình 3.12c, 3.12d). Việc ghi nhận biểu hiện GUS ở các giai đoạn hình thành phôi soma (phôi cầu, phôi trái tim, phôi có lá mầm) cũng đã được thực hiện với kết quả được trình bày ở hình 3.12e, 3.12f, 3.12g.

Kết quả biểu hiện GUS dương tính chứng tỏ mô giả định chuyển gen có mang gen gusA. Các dòng này tiếp tục được chọn lọc và được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt bằng phương pháp PCR.

3.2.3.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt bằng phương pháp PCR

Các mẫu mô sâm sau quá trình nuôi chung được nuôi cấy nhiều chu kỳ trên môi trường chọn lọc (môi trường S2 có bổ sung hygromycin từ thấp đến cao, 15 – 25 mg/l và cefotaxime giảm dần, từ 500 mg/l xuống 250 mg/l) trong nhiều tháng (3 tháng trở lên). Trong quá trình chọn lọc, ở thời gian đầu đa số các mẫu chuyển sang màu nâu và không còn khả năng tăng trưởng. Bên cạnh đó, ở một số ít mẫu xuất hiện các cụm tế bào màu vàng tươi. Nếu các cụm mô này có khả năng tăng sinh, tiếp tục trên môi trường có nồng độ tác nhân chọn lọc cao hơn và đây là những dòng tế bào có thể được xem là giả định chuyển gen. Chúng được tiếp tục cấy

Hình 3.12. Thử nghiệm hóa mô GUS mô chuyển gen.

a. Biểu hiện GUS tạm thời sau 5 ngày (vị trí mũi tên); b. Biểu hiện GUS bền vững sau 1 tháng nuôi cấy; c, d. Biểu hiện GUS bền vững sau 3 tháng chọn lọc của hai dòng mô sẹo chuyển gen 1 và 2; e. Biểu hiện GUS ở phôi soma giai đoạn hình cầu (vị trí mũi tên); f. Biểu hiện GUS ở phôi soma giai đoạn hình trái tim (vị trí mũi tên); g. Biểu hiện GUS ở phôi soma giai đoạn có lá mầm (vị trí mũi tên)

a b c

d e f g

truyền đến khi mô tăng trưởng ổn định và đạt kích thước tương đối thì được cắt lấy một phần nhỏ (khoảng 100 mg) đem tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR để kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt.

Như đã trình bày, phản ứng PCR gồm 01 ống đối chứng dương (chứa plasmid pVDH396), 01 ống đối chứng âm (chứa mẫu đối chứng không chuyển chuyển gen), còn lại là 2 ống chứa mẫu giả định chuyển gen (chọn hai dòng mô để kiểm tra).

Kiểm tra bằng phản ứng PCR, điện di sản phẩm và chụp ảnh gel, kết quả được thể hiện ở hình 3.13 và hình 3.14.

Hình 3.13. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen hpt (băng DNA 800 bp) Dãy 1: thang chuẩn 1kb; Dãy 2: plasmid pVDH396 (đối chứng dương); Dãy 3: DNA mẫu đối chứng; Dãy 4: DNA mẫu chuyển gen 1; Dãy 5: DNA mẫu chuyển gen 2.

800 bp

1 2 3 4 5

1kb 750bp

Như vậy có sự tạo các băng DNA kích thước 800 bp và 615 bp qua sự khuếch đại đoạn gen hpt và gen ipt.

Các dòng sau kiểm tra dương tính sự có mặt của gen ipt và gen hpt tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường tạo chồi C2 có bổ sung hygromycin và cefotaxime với nồng độ thấp, lần lượt là 10 mg/l và 250 mg/l, nhằm tạo điều kiện thúc đẩy sự tái sinh. Qua quá trình cấy chuyển liên tục 2 tuần/lần trong thời gian sau khoảng 6 tuần, ở các cụm mô sẹo này có sự hình thành chồi (Hình 3.15). Số lượng chồi tuy ít nhưng xét về hình thái, các chồi này to và có lá màu xanh đậm.

Đồng thời với quá trình cấy chuyển tái sinh các cụm mô sẹo chuyển gen, các mẫu mô sẹo sâm đối chứng (không qua chuyển gen) cũng được tiến hành thử nghiệm nuôi cấy tái sinh trên môi trường tạo chồi C2 có bổ sung hygromycin (10 mg/l); kết quả cho thấy ở các cụm mô đối chứng không có hiện tượng phát sinh hình thái chồi. Kết quả này tương tự kết quả thí nghiệm của Franklin và cs. (2009).

615 bp 1 2 3 4 5

1kb 750bp

Hình 3.14. Ảnh chụp gel điện di sản phẩm PCR gen ipt (băng DNA 650 bp) Dãy 1: thang chuẩn 1kb; Dãy 2: plasmid pVDH396 (đối chứng dương); Dãy 3: DNA

mẫu đối chứng; Dãy 4: DNA mẫu chuyển gen 1; Dãy 5: DNA mẫu chuyển gen 2.

Như vậy, kết quả cho thấy có sự khác biệt về khả năng tái sinh (với sản phẩm lá tái sinh to khỏe, xanh và có sức sống) giữa mô chuyển gen và mô không chuyển gen;

điều này theo chúng tôi là do mô chuyển gen sản sinh enzyme HPT làm bất hoạt hygromycin, ngoài ra có thể do có hàm lượng cytokinin nội sinh cao hơn bình thường. Kết quả này tương tự như kết quả ở nhiều nghiên cứu khác của các tác giả Sakakibara (2006), Haberer và Kieber (2002), Howell và cs. (2003), Kakimoto (2003), Geng và cs. (2001).

Chuyển gen ở các loài Panax đã được thực hiện vào khoảng thập niên 80;

trong đó, hai loài được chú ý nghiên cứu nhiều nhất là Nhân sâm (Panax ginseng C.A. Mey.) và sâm Mỹ (Panax quinquefolium L.). Mục đích của việc nghiên cứu các đối tượng này chủ yếu là nhằm gia tăng mức ginsengnoside hoặc tăng khả năng kháng bệnh hại của các loài này qua các nghiên cứu của Yoskikawa và Furuya (1987), Hwang và cs. (1991), Inomata và cs. (1993), Ananchanok Tirajoh (1996).

Điều đáng chú ý là sau chuyển gen, các tác giả đều nhận thấy khả tái sinh của mô bị giảm. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh có thể là do mẫu cấy, quá trình gây nhiễm, điều kiện nuôi chung với vi khuẩn hay do môi trường chọn lọc, tái sinh sau chuyển gen chưa thực sự thích hợp (Garcia và cs., 1986; Perkins và cs., 1987;

Mathew và cs., 1990). Trong nghiên cứu đề tài này, qua sự hình thành các chồi từ mẫu chuyển gen cho thấy các xử lý trong nuôi cấy, chọn lọc và tái sinh đã tương đối thích hợp. Chồi có màu xanh đẹp có thể do gen ipt sau khi được biến nạp vào tế bào đã hoạt động, kích thích việc sản sinh cytokinin. Ở kết quả thí nghiệm trên cây Thanh hao (Artemisia annua L.) của Geng và cs. (2001) thì mức cytokinin nội sinh trong tế bào tỷ lệ thuận với hàm lượng diệp lục tố và hợp chất thứ cấp artemisinin.

Đối với kết quả chuyển gen ở sâm Ngọc Linh, hy vọng rằng hàm lượng saponin cũng có thể được gia tăng qua tác động của gen ipt hiện diện trong tế bào – làm thay đổi theo chiều hướng tích cực trạng thái sinh lý hóa sinh của cây.

\

Hình 3.15. Chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen a, b. Sau 4 tuần; c. Sau 5 tuần; d. Sau 6 tuần; e. Sau 8 tuần

d

e c

a 1 cm

1 cm

b

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN

Từ kết quả nhận được, chúng tôi rút ra những kết luận sau:

1. Tạo được mô sẹo từ vật liệu lá và cuống lá sâm Ngọc Linh dung môi trường MS bổ sung 1 mg/l 2,4-D.

2. Môi trường thích hợp cho sự tăng sinh khối mô sẹo lá sâm Ngọc Linh là môi trường MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ.

3. Môi trường thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh là môi trường môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA và 1 mg/l BA.

4. Nồng độ hygromycin 25 mg/l thích hợp cho việc chọn lọc tế bào chuyển gen sâm Ngọc Linh.

5. Đã nhận được 04 dòng mô sẹo sâm Ngọc Linh chuyển gen đang trong quá trình tái sinh nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens; các dòng mô này đã được kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen gusA, gen hpt và gen ipt bằng thử nghiệm hóa mô GUS và bằng phương pháp PCR. Tần số chuyển gen đạt khoảng 0,5%.

2. ĐỀ NGHỊ

Cũng từ kết quả nhận được, chúng tôi có các đề nghị sau:

+ Khảo sát các điều kiện tối ưu nhằm tăng tần số chuyển gen (thời gian nuôi chung mô với vi khuẩn, mật độ vi khuẩn, nồng độ acetosyringone,…).

+ Tiếp tục thực hiện các bước thí nghiệm nhằm tạo cây sâm Ngọc Linh chuyển gen hoàn chỉnh từ mô phôi và đưa ra trồng ở vườn ươm.

+ Kiểm tra, phân tích một số chỉ tiêu sinh lý hóa sinh cơ bản như hàm lượng cytokinin, hàm lượng diệp lục tố,… đặc biệt là hàm lượng hợp chất thứ cấp trong mô/cây sâm chuyển gen.