2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Thí nghiệm chuyển gen
2.2.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen Mục đích
Xác định nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp (tối thiểu gây chết) để chọn lọc tế bào ở thí nghiệm chuyển gen.
Cách tiến hành
+ Nuôi các cụm mô sẹo lá (≈ 5 mm) trên môi trường S2 có bổ sung hygromycin với các nồng độ 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40 (mg/l). Mỗi nồng độ thực hiện với 5 mẫu, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
+ Theo dõi trạng thái và số mô sẹo còn sống sau 8 tuần.
+ Kết luận nồng độ hygromycin thích hợp sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen.
2.2.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens a. Biến nạp plasmid vào E. coli, nuôi vi khuẩn và tách chiết plasmid a.1. Biến nạp plasmid vào E. coli
+ Biến nạp plasmid vào E. coli được thực hiện bằng phương pháp gây sốc nhiệt ở 42PoPC trong 2 phút (Sambrook và cs., 1989).
a.2. Nuôi vi khuẩn và tách chiết plasmid E. coli biến nạp Các bước thực hiện
- Nuôi lắc vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng LB qua đêm có bổ sung kháng sinh tương ứng kanamycin 100 mg/ml.
- Tách chiết plasmid vi khuẩn:
Sử dụng bộ kit tách chiết plasmid vi khuẩn: WizardPRP Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega); thực hiện các bước tách chiết như sau:
+ Ly tâm kết lắng tế bào vi khuẩn từ 3 – 5 ml huyền phù nuôi cấy lắc ở tốc độ 10.000 vòng trong 10 phút. Bỏ phần nổi (supernatant) và thấm khô ống chứa bằng cách úp ngược ống trên một tờ giấy thấm.
+ Huyền phự húa hoàn toàn cỏc tế bào kết lắng trong 300 àl dung dịch tỏi huyền phù (Cell Resuspension Solution). Chuyển huyền phù tế bào vào ống ly tâm nhỏ 1,5 ml.
+ Thờm 300 àl dung dịch tự phõn tế bào (Cell Lysis Solution) và trộn đều bằng cách đảo ngược ống 4 lần. Huyền phù tế bào sẽ được làm sạch.
+ Thờm 300 àl dung dịch trung hũa (Neutralization Solution) và trộn đều bằng cỏch đảo ngược ống vài lần. Nếu dựng chuỗi EndA+, thờm 600 àl dung dịch trung
hòa, đảo trộn bằng cách lật ngược 4 lần, ủ hỗn hợp tự phân trong bồn ổn nhiệt trong 10 phút.
+ Ly tâm hỗn hợp tự phân ở 10.000 vòng trong 10 phút a.3. Tinh sạch và bảo quản plasmid
Các bước thực hiện
+ Với mỗi Miniprep chuẩn bị một Wizard Minicolumn. Hút 1 ml dung dịch DNA Purification Resin cho vào xy-ranh. Cẩn thận hút dịch trong mỗi Miniprep (supernatant của phần tách chiết) và chuyển vào trong ống của Minicolumn/xy-ranh đã chứa sẵn chất sền sệt.
+ Gắn piston vào và đẩy nhẹ nhàng dịch chảy vào Minicolumn. Tháo xy-ranh khỏi cột và tháo piston khỏi xy-ranh, gắn ống của xy-ranh trở lại Minicolumn. Hút 2 ml dung dịch rửa cột (Column Wash Solution) sau khi đã thêm cồn vào ống xy- ranh, gắn piston vào và đẩy dịch rửa cột chảy qua Minicolumn.
+ Tháo xy-ranh và chuyển Minicolumn vào ống ly tâm nhỏ 1,5 ml. Ly tâm Minicolumn ở 10.000 vòng trong 2 phút bằng máy ly tâm nhỏ để làm khô.
+ Chuyển Minicolumn vào một ống ly tõm 1,5ml khỏc. Thờm 50àl dung dịch đệm TE vào Minicolumn và chờ trong 1 phút. Ly tâm 10.000 vòng trong máy ly tâm nhỏ trong 20 giây để thu nhận plasmid DNA.
+ Tháo và bỏ Minicolumn. DNA plasmid được giữ ở nhiệt độ - 20PoPC.
b. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pVDH396 trong E. coli bằng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn NcoI
Plasmid sau tách chiết được xử lý với enzyme cắt giới hạn là NcoI. Điện di sản phẩm sau phản ứng cắt để kiểm tra kích thước của plasmid.
Hỗn hợp phản ứng như sau:
+ DNA plasmid: 20 àl + Buffer: 3 àl
+ Enzyme NcoI: 2 àl + BSA: 1 àl
Tổng thể tớch: 26 àl
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 2 - 3 giờ ở 37PoPC. Sản phẩm cắt được đem điện di cùng với thang chuẩn λ-HindIII.
* Chạy điện di DNA trên bản gel:Cân 1g agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE đun cho núng chảy; để nguội đến 60PoPC, cho vào 2 àl ethidium bromide. Sau đó đổ vào khuôn đã có sẵn lược để tạo giếng, chờ dung dịch nguội hoàn toàn. Nhẹ nhàng rút lược ra, cho gel vào hộp điện di chứa dung dịch đệm TAE và cho dịch DNA plasmid (đã có dung dịch nhuộm màu xanh) vào, cắm điện cực chạy ở 75 volt trong 2 giờ. Xem bản gel dưới đèn cực tím.
Sau khi đã kiểm tra được sự hiện diện của plasmid pVDH396, plasmid này sẽ được biến nạp vào trong A. tumefaciens bằng cách gây sốc nhiệt để tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA 4404. Vi khuẩn A. tumefacien LBA 4404 được cấy trong 10 ml môi trường LB (Chilton và cộng sự., 1974) lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/l, lắc qua đêm với tốc độ 250 rpm ở 28P0PC và được sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen.
c. Tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid pVDH396 dùng chuyển gen
Việc tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid pVDH396 cũng được thực hiện bằng phương pháp gây sốc nhiệt tương tự như đối với E. coli.
d. Chuẩn bị mẫu chuyển gen
Các cụm mô sẹo lá (5 mm) được cấy trên môi trường tạo mô sẹo S2 trong hai ngày ở điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng 25P0PC ± 2, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng ≈ 3000 lux.
e. Gây nhiễm và nuôi chung mô sẹo với vi khuẩn A. tumefaciens
Mô sẹo sau hai ngày tiền nuôi cấy (preculture) được gây nhiễm bằng cách chuyển vào đĩa petri có chứa dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị, bổ sung acetosyringone 100 àM để tăng khả năng cảm ứng chuyển gen của vi khuẩn.
Sau 20 phút, các mô sẹo được vớt ra, đặt trên tờ giấy thấm vô trùng khoảng 10 phút để thấm bớt dịch vi khuẩn thừa. Sau đó các mô sẹo này được cấy trở lại môi
trường tạo mụ sẹo S2 cú bổ sung 100 àM acetosyringone; nuụi ủ trong tối 2 ngày ở nhiệt độ 24P0PC.
f. Rửa vi khuẩn và chọn lọc
Sau hai ngày, mô sẹo được rửa bằng nước cất vô trùng vài lần đến khi thấy dịch rửa trong. Lần rửa cuối bổ sung cefotaxime 500 mg/l, lắc nhẹ trong 15 phút.
Gắp các mẫu mô sẹo ra tờ giấy thấm vô trùng, để khoảng 10 phút.
Cấy các mẫu mô sẹo vào môi trường S2 có bổ sung 15 mg/l hygromycin và 500 mg/l cefotaxime.
Theo dõi và cấy chuyển 2 tuần/lần sang cùng môi trường nhưng có 25 mg/l hygromycin ở các lần cấy chuyển sau. Thực hiện ít nhất 4 lần cấy chuyển chọn lọc.
Trong quá trình cấy chuyển, chọn lọc các mô vẫn còn khả năng tăng trưởng;
những mô không được chuyển gen bị nâu, chết được loại bỏ. Cấy riêng rẽ các mô sống từ một cụm thành một dòng (thao tác tách dòng).
Những dòng mô còn sống sau quá trình chọn lọc dài được xem là những dòng mô giả định chuyển gen. Các dòng này được kiểm tra sự hiện diện của gen đích ipt và các gen khác; chúng tiếp tục được cấy chuyển sang môi trường tạo chồi C2 có bổ sung chất kháng sinh với nồng độ giảm so với trước đây: 10 mg/l hygromycin và 250 mg/l cefotaxime.
2.2.3. Kiểm tra sự hiện diện/biểu hiện của các gen chuyển
2.2.3.1. Kiểm tra sự hiện diện và biểu hiện của gen chỉ thị gusA bằng kỹ thuật hóa mô Mục đích
Kiểm tra nhanh sự có mặt của gen chỉ thị gusA trong bộ gen của mô sâm giả định chuyển gen bằng dung dịch X-Gluc.
Cách tiến hành
Ngâm các mẫu mô sâm giả định chuyển gen (mô sẹo, mô phôi) với dung dịch X-Gluc khoảng 12 giờ ở 37PoPC.
Rửa mẫu bằng dung dịch cồn 70% cho đến khi mất màu diệp lục và quan sát màu xanh chàm dưới kính hiển vi soi nổi (đối với mẫu biểu hiện mạnh thì có thể nhận thấy ngay màu xanh đặc trưng sau khi ủ mẫu qua đêm mà chưa cần rửa bỏ diệp lục tố).
• Nếu là mẫu chuyển gen thì mẫu có màu xanh chàm (indigo) đặc trưng, còn mẫu đối chứng sẽ biểu hiện âm tính (không có màu).
2.2.3.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt bằng phương pháp PCR a. Tách chiết DNA nhiễm sắc thể của mô sâm giả định chuyển gen Mục đích
Thu nhận DNA dùng cho phản ứng PCR để xác định sự hiện diện của gen hpt và gen ipt.
Cách tiến hành
+ Cắt nhỏ 200-500 mg mẫu mô sâm cho vào ống eppendorf.
+ Nghiền mẫu trong 400 àl dung dịch tỏch chiết DNA.
+ Cho 30 àl dung dịch SDS 20% và ủ ở 65PoPC trong 10 phỳt.
+ Thờm 400 àl phenol/chloroform, trộn đều hỗn hợp và ly tõm 14.000 vũng trong 5 phút.
+ Thu lấy dịch nổi vào một ống eppendorf mới.
+ Thờm vào 300 àl isopropanol trộn đều và giữ lạnh trong đỏ 10 phỳt.
+ Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.
+ Rửa tủa thu được với 100 àl ethanol 70%. Ly tõm 10.000 vũng/phỳt trong 2 phút và loại bỏ ethanol.
+ Để khụ mẫu khoảng 20-30 phỳt. Hũa tan mẫu trong 40àl TE.
+ Thờm 2 àl RNase, ủ ở 37PoPC trong 30 phỳt để loại RNA trong mẫu.
+ DNA thu được có thể sử dụng ngay hay bảo quản ở -20PoPC.
b. Kiểm tra sự hiện diện của gen hpt và gen ipt ở mô giả định chuyển gen bằng phương pháp PCR
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR
Thành phần Thể tích sử dụng
(tổng thể tích là 25 μl)
Nước không chứa nuclease 15 μl
PCR Buffer Gotag 5X 5 μl
dNTP (1 mM) 0,5 μl
Mồi xuôi (5 μM) 1 μl
Mồi ngược (5 μM) 1 μl
Taq polymerase (5 unit/μl) 0,5 μl
DNA 2 μl
Các mẫu trong phản ứng PCR gồm có một ống đối chứng dương (chứa plasmid pVDH396 mang gen đã biết), một ống đối chứng âm (mẫu đối chứng không chuyển gen), các mẫu còn lại là các mẫu cần xác định sự hiện diện của gen chuyển.
Chuẩn bị ống Master mix: cho tất cả các hoá chất trên (trừ mẫu) vào ồng eppendorf 1.500 μl trộn đều (có thể ly tâm ngắn 10.000 rpm trong 1 phút).
Đánh số thứ tự các ống eppendorf dùng PCR.
Cho 23 μl dung dịch trong ống Master vào eppendorf nhỏ dùng trong PCR.
Sau đó lần lượt cho mẫu đối chứng dương, đối chứng âm và các mẫu còn lại vào ống eppendorf.
Đặt các ống eppendorf vào máy PCR, vặn chặt nắp và chạy ở các chương trình như sau:
- Đối với gen hpt: 94PοPC: 5 phút; 35 chu kỳ (94PοPC: 1 phút, 62PοPC: 1 phút, 72PοPC:
1 phút); 72PοPC: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 800 bp.
- Đối với gen ipt: 95PοPC: 2 phút; 30 chu kỳ (95PοPC: 1 phút, 55PοPC: 1 phút, 72PοPC: 2 phút); 72PοPC: 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 615 bp.
Sau khi chạy PCR xong, nạp mẫu vào các giếng trong gel agarose để chạy điện di.
Phương pháp điện di
• Đổ gel 0,8% agarose:
∗ Cân 0,4 g agarose cho vào 50 ml dung dịch TAE 1X.
∗ Đun hỗn hợp trong lò vi ba khoảng 1 phút.
∗ Lắc đều, chờ cho dung dịch gel nguội bớt; cho 1 μl Ethydium Bromide vào nhằm quan sát DNA phát huỳnh quang dưới tia UV.
∗ Gắn lược vào khay đổ gel, từ từ đổ dung dịch gel vào khay đổ gel, chờ cho gel đông cứng lại.
• Tiến hành điện di:
∗ Sau khi gel agarose đã đông đặc, nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi gel rồi từ từ nhấc khay đổ gel đặt vào máy chạy điện di.
∗ Đổ dung dịch đệm TAE 1X vào máy chạy điện di sao cho cao hơn miếng gel khoảng 3 – 5 mm.
∗ Đầu tiên nạp ladder λ DNA cắt hạn chế HindIII (23 kb) vào giếng, sau đó lần lượt nạp các mẫu còn lại vào các giếng trên miếng gel.
∗ Đậy nắp máy chạy điện di. Chạy điện di dùng dòng điện hiệu thế 80 V khoảng một giờ.
• Sau khi chạy điện di, lấy gel ra, quan sát và chụp kết quả khuếch đại DNA bằng hệ thống chụp ảnh gel điện di BioradP®P. Nếu là sản phẩm chuyển gen, quá trình soi bản gel sẽ cho thấy hiện băng DNA được khuếch đại với kích thước biết trước. Như đã trình bày ở trên, chiều dài đoạn gen ipt và hpt được nhân lên có kích thước lần lượt là 615 bp và 800 bp.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN