3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.5.1 Tách chiết DNA
Tách chiết DNA PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE
Các PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE không chuyển gen và chuyển gen sau quá trình chọn lọc sẽ được đem đi tách chiết DNA.
Chọn lấy 2 nhóm mẫu PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE chưa chuyển gen, mỗi nhóm cân khoảng 0.2mg.
Chọn lấy 8 nhóm mẫu PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE giả định chuyển gen ứng với 8 dòng thu được sau quá trình chọn lọc, mỗi nhóm cân khoảng 0.2mg.
Kết quả tách chiết DNA được xác định bằng kỹ thuật diện di trên gel agarose và độ tinh sạch của DNA sau tách chiết được đo bằng máy Nano Drop.
Hình 3.7 Kết quả điện di DNA PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE
Giếng 1-2: các mẫu PLB không chuyển gen Giếng 3-10: các mẫu PLB giả định chuyển gen
Kết quả diện di DNA trên gel agarose (hình 3.7) sau khi tách chiết cho thấy: tất cả 10 nhóm mẫu PLB đem đi tách chiết DNA đều xuất hiện các vạch sáng dưới tia UV. Đều này chứng tỏ là tất cả các mẫu tách chiết đều có DNA và nguyên vẹn.
Bảng 3.6 Kết quả đo OD DNA PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE Mẫu Hàm lƣợng(ng/µl) OD260/OD280 C1 2506.4 2.00 C2 2285.4 1.99 T1 1912.0 1,98 T2 631.3 1.95 T3 436.3 1.92 T4 363.6 2.01 T5 465.6 1.99 T6 357.7 1.94 T7 682.4 1.97 T8 703.7 1.89
Sau khi tách chiết xong DNA, tiến hành đo OD của các mẫu DNA này. Để đánh giá độ tinh sạch của DNA sau tách chiết, căn cứ vào thông số OD260/OD280. Mẫu DNA được xem là tinh sạch nếu OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8-2. Theo kết quả đo OD ở bảng 3.6, tất cả các mẫu đều thỏa mãn điều kiện. Do đó, tất cả các mẫu DNA tách chiết này đều có thể đem đi thực hiện phản ứng PCR.
Tách chiết DNA plasmid pGII2290 TRgus cpl48 luc
Hình 3.8 Kết quả điện di DNA plasmid pGII2290 TRgus cpl48 luc của A. tumefaciens
Song song với quá trình tách chiết DNA của các mẫu PLB để làm chứng âm cũng như các mẫu cần kiểm tra sự hiện diện của gen bar, thì cũng thực hiện việc tách chiết DNA plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens để làm chứng dương.
Kết quả điện di DNA plasmid vi khuẩn sau tách chiết trên gel agarose (hình 3.8) cho thấy: cả hai mẫu DNA plasmid vi khuẩn đều xuất hiện hai vạch sáng dưới tia UV. Điều này chứng tỏ là cả hai mẫu đều có DNA.
Bảng 3.7 Kết quả đo OD DNA plasmid pGII2290 TRgus cpl48 luc của A. tumefaciens
Mẫu Hàm lƣợng(ng/µl) OD260/OD280
P1 236.1 1.95
P2 281.6 1.93
Kết quả đo OD của DNA plasmid vi khuẩn nằm ở bảng 3.7. Trong bảng này, thông số OD260/OD280 đều nằm trong khoảng 1,8-2, nên cả hai mẫu DNA đều tinh sạch và đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR.
3.5.2 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc bằng kỹ thuật PCR
Các mẫu DNA đã tách chiết ở thí nghiệm trước được đem đi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi BAR3/BAR4 để khuếch đại một trình tự chuyên biệt nằm trong gen mục tiêu (gen bar). Cặp mồi BAR3/BAR4 sẽ khuếch đại một vùng của gen bar có kích thước là 231bp.
Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi BAR3/BAR4
Giếng 1, 10: thang chuẩn 100bp Plus DNA
Giếng 2, 12: sản phẩm PCR của PLB chưa chuyển gen (chứng âm) Giếng 4: nước cất (chứng âm)
Giếng 3, 11: sản phẩm PCR của plasmid vi khuẩn A. tumefaciens (chứng dương)
Giếng 5-9, 13-15: sản phẩm PCR của PLB được chuyển gen bằng A. tumefaciens
Hình 3.9 là kết quả điện di của các sản phẩm PCR. Qua kết quả bảng điện di, cho thấy:
Ở giếng 2, là sản phẩm điện di của PLB đối chứng (PLB chưa chuyển gen, không thấy xuất hiện vạch nào cả, nghĩa là mẫu PLB này không có mang gen bar.
1000bp 500bp 200bp 231bp 231bp 1000bp 500bp 200bp
Ở giếng 4, chỉ là nước cất, nên sẽ không có xuất hiện vạch nào cả.
Ở giếng 3, là sản phẩm điện di của plasmid vi khuẩn A. tumefaciens EHA101 (chứng dương), thấy có xuất hiện một vạch sáng tại vị trí gần với vạch 200bp của thang 100bp Plus DNA, nghĩa là có xuất hiện sản phẩm khuếch đại dài 231bp từ mẫu chứng dương.
Ở các giếng 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15 cũng thấy xuất hiện ở mỗi giếng có một vạch sáng tại vị trí gần với vạch 200bp của thang 100bp Plus DNA, nghĩa là có xuất hiện sản phẩm khuếch đại dài 231bp trong các mẫu DNA giả định chuyển gen. Nói cách khác, các mẫu PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE đem đi thực hiện phản ứng PCR đều có mang gen bar.
Như vậy, với kết quả PCR thu được ở trên, có thể khẳng định rằng có sự hiện diện của gen bar trong DNA bộ gen của tế bào lan Dendrobium CV. BURANA WHITE sau quá trình chuyển gen. Ngoài ra, kết quả PCR cũng cho thấy sự ổn định trong quá trình chuyển gen khi dùng vi khuẩn A. tumefaciens (100% mẫu kiểm tra đều có vạch với kích thước 231bp).
3.6 Khảo sát khả năng kháng chịu với PPT của PLB Dendrobium CV.
BURANA WHITE chuyển gen
Các PLB chuyển gen sau quá trình tái sinh sẽ tiếp tục đem đi thử nghiệm khả năng kháng chịu với PPT ở những nồng độ khác nhau.
Mặc dù khi đã chuyển gen thành công, tức là PLB đã có mang gen bar, thì khi cấy chúng lên môi trường có bổ sung PPT, lẽ ra chúng sẽ sống được trên môi trường đó. Tuy nhiên, khả năng sống của các PLB này còn tùy vào liều lượng PPT được bổ sung vào. Nếu liều lượng quá cao có thể gây ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, làm cho các mô bị hóa nâu và chết dần. Do đó, cần phải khảo sát tiếp khả năng kháng chịu với PPT ở nồng độ cao hơn, để từ đó có thể đánh giá sơ bộ về khả năng biểu hiện của gen chuyển ngoại lai (trong trường hợp này là gen bar) như thế nào, cũng như ngưỡng chịu đựng tối đa của cây chuyển gen với tác nhân chọn lọc.
Bảng 3.8 Khả năng kháng chịu với nồng độ PPT của PLB chuyển gen Dendrobium CV. BURANA WHITE Nồng độ PPT (mg/L) 0 1 2 3 4 5 % mẫu sống 100% 100% 100% 100% 100% 95% Sự kháng chịu Có Có Có Có Có Có
Bảng 3.8 là kết quả thử nghiệm khả năng kháng chịu PPT của PLB
Dendrobium CV. BURANA WHITE, cho thấy sau 3 tuần nuôi cấy các PLB chuyển gen trên môi trường MS có bổ sung PPT với các nồng độ: 0, 1, 2, 3, 4,5 mg/L, tỷ lệ PLB sống rất cao, hầu như là 100%, ngoại trừ ở nồng độ PPT 5mg/L, tỷ lệ sống thấp hơn đôi chút (95%), chết khoảng 5%. Như vậy, ở nồng độ PPT dưới 5mg/L, các PLB chuyển gen có khả năng kháng tốt. Còn ở nồng độ PPT 5mg/L, mặc dù có một vài PLB chết, có lẻ là do thao tác cắt mẫu đã làm tổn thương đến mẫu bởi vì trong khoảng thời gian ngắn (3 tuần) như vậy thì PLB không thể chết sớm như vậy được, nhưng nhìn chung PLB cũng có khả năng sống được ở nồng độ PPT 5mg/L này. Như vậy, có thể nói rằng các PLB chuyển gen có khả năng kháng chịu được với PPT ở nồng độ cao nhất là 5mg/L sau 3 tuần nuôi cấy.
Như vậy, nồng độ PPT cao nhất mà PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE có thể kháng chịu được sau 3 tuần nuôi cấy là 5mg/L.
Hình 3.10 Khả năng kháng chịu với PPT của PLB chuyển gen Dendrobium CV. BURANA WHITE sau 3 tuần nuôi cấy
PPT 0mg/L PPT 1mg/L PPT 2mg/L
PPT 5mg/L PPT 4mg/L
TÓM TẮT QUY TRÌNH CHUYỂN GEN bar VÀO PHONG LAN
DENDROBIUM CV. BURANA WHITE BẰNG VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
Tái sinh các PLB chuyển gen
PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE
A. tumefaciens EHA101
Rửa sạch vi khuẩn A. tumefaciens EHA101
Các PLB mang gen bar
Chọn lọc PLB
100µM acetosyringone 5 ngày đồng nuôi cấy
20mg/L meropenem
Môi trường MS bổ sung: 15mg/L meropenem
3mg/L PPP (8 tuần)
Chương 4
KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ