2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2.4 Tái sinh các mẫu PLB giả định chuyển gen bằng A.tumefaciens trên
trƣờng chọn lọc có bổ sung PPT
Mục tiêu
Thu nhận các mẫu PLB mang gen bar có khả năng kháng được PPT. Xác định hiệu suất chuyển gen.
Phương pháp thực hiện
Từ các kết quả thu được ở các thí nghiệm ở trên, chọn ra điều kiện tối ưu nhất để thực hiện lại toàn bộ quy trình chuyển gen.
Các mẫu PLB sau khi ủ với vi khuẩn sẽ được rửa sạch với dung dịch meropenem 20mg/L. Sau đó, thấm khô mẫu bằng giấy thấm vô trùng.
Tiếp đó, đặt các mẫu PLB vào môi trường MS có bổ sung PPT 1mg/L.
Sau 4 tuần chọn lọc, chuyển toàn bộ các PLB này sang môi trường MS có bổ sung PPT 3mg/L. Cấy chuyền các mẫu PLB sang môi trường MS có bổ sung PPT sau 2 tuần một lần.
Sau 4 tuần chọn lọc, chuyển các PLB còn sống vào các đĩa petri có môi trường MS, không có bổ sung PPT để các PLB tái sinh.
Chỉ tiêu theo dõi
Số mẫu PLB còn sống sau 8 tuần chọn lọc.
Khả năng tăng trưởng của PLB trong môi trường chọn lọc. Hiệu suất chuyển gen sau 8 tuần
2.2.5 Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc bằng kỹ thuật PCR
Tách chiết DNA PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE
Mục tiêu
Thu nhận DNA nguyên vẹn và tinh sạch từ PLB tái sinh sau quá trình chuyển gen.
Phương pháp thực hiện
Chọn các PLB giả định chuyển gen sau quá trình tái sinh và các PLB không chuyển gen.
Cân 0.2g mẫu PLB cho vào cối và nghiền trong Nitơ lỏng.
Thêm 800µl CTAB vào cối để tái huyền phù bột đã nghiền. Sau đó, đưa toàn bộ dịch huyền phù này vào các eppendorf có chứa sẵn 10µl Beta- mercaptoethanol và 4µl RNAse A. Đảo ống eppendorf vài lần.
Ủ các ống trên ở 650
C trong 1 giờ. Đảo ống mỗi 20 phút.
Thêm 700µl Phenol:Chloroform:Iso-amyl alcohol (PCI) (25:24:1) vào mỗi ống. Đảo ống nhẹ nhàng trong 1 phút, ly tâm 13000 vòng/15 phút. Chuyển lớp dịch nổi phía trên qua eppendorf 2ml mới.
Lặp lại bước 5.
Thêm 500µl Chloroform, trộn đều bằng cách đảo ống nhẹ nhàng, ly tâm ở 10000 vòng/5 phút.
Chuyển nhẹ nhàng phần dịch phía trên qua eppendorf 2ml mới có chứa 800µl Isopropanol lạnh. Để yên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 5-10 phút (DNA sẽ tủa ở dạng tơ trắng). Ly tâm lạnh ở 40C ở 13000 vòng/2-3 phút. Sau đó, cẩn thận loại hết Isopropanol, thu tủa.
Rửa lại bằng ethanol 800 lạnh.
Ly tâm lạnh ở 40C ở 13000 vòng/2-3 phút. Cẩn thận loại bỏ hết ethanol còn thừa, để tủa tự khô ở nhiệt độ phòng (24-270C). Thu tủa.
Hòa tan tủa trong 100µl 0.1X TE ấm. Bảo quản DNA tinh khiết ở -200C. Đo độ tinh sạch (OD260/OD280) và hàm lượng DNA bằng máy Nano Drop.
Chỉ tiêu theo dõi
So sánh độ tinh sạch và hàm lượng DNA trong mỗi mẫu. Quan sát kết quả điện di trên gel agarose.
Tách chiết plasmid vi khuẩn A. tumefaciens EHA101
Mục tiêu
Thu nhận plasmid pGII0229TRgus cp148 tinh sạch từ A. tumefaciens
EHA101 để làm chứng dương cho quá trình chạy PCR.
Phương pháp thực hiện
Lấy 1.5ml dịch vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có bổ sung kháng sinh (50mg/L rifamycin và 50mg/L kanamycin) cho vào eppendorf vô trùng.
Ly tâm 10000 vòng trong 5 phút, thu tủa.
Thêm vào 100µl dung dịch SOL1 (phụ lục 7) và votex kỹ.
Thêm vào 200µl dung dịch SOL2 (phụ lục 7), trộn đều, để yên trong 3 phút. Thêm vào 30µl phenol pH8, đảo đều, để lạnh.
Thêm vào 100µl dung dịch SOL3 (phụ lục 7), trộn đều, để yên trong 30 phút (giữ lạnh trên đá).
Ly tâm lạnh 40C với vận tốc 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi. Bổ sung 200µl phenol/chloroform (1:1) pH8, đảo nhẹ, để lạnh.
Ly tâm lạnh 40C với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. Thêm 1ml Ethanol 100% ở 40C, trộn đều.
Ly tâm lạnh 40C với vận tốc 13000 vòng/phút trong 20 phút, thu tủa. Rửa tủa với 0.5ml Ethanol 80% lạnh.
Ly tâm lạnh 40C với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút. Thu tủa. Để tủa tự khô ở nhiệt độ phòng (240C-270C).
Hòa tan tủa trong 20µl 0.1X TE và ủ với 2µl dung dịch RNase (1mg/ml) trong 1giờ ở 370C.
Plasmid tinh khiết được bảo quản ở -200C
Sản phẩm DNA sẽ được kiểm tra độ tinh sạch (OD260/OD280) và tính hàm lượng DNA (ng/µL) bằng máy Nano Drop.
Các mẫu DNA cũng sẽ được phân tích điện di trên gel agarose 2% trong dung dịch đệm TAE 1X dưới hiệu điện thế 100V/40 phút. Gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide và quan sát trên đèn UV.
Chỉ tiêu theo dõi
So sánh độ tinh sạch và hàm lượng DNA trong mỗi mẫu. Quan sát kết quả điện di trên gel agarose.
Kiểm tra sự hiện diện của gen bar trong PLB tái sinh trên môi trường chọn lọc bằng kỹ thuật PCR
Mục tiêu
Chứng minh các PLB tái sinh trên môi trường chọn lọc có mang gen bar do vi khuẩn A. tumefacients chuyển vào thành công.
Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị các eppendorf sạch, vô trùng. Cho vào eppendorf hỗn hợp mastermix với liều lượng ứng với cặp mồi BAR3/BAR4 (bảng 2.2) như sau:
Bảng 2.2 Mastermix của cặp mồi BAR3/BAR4
Hóa chất Nồng độ cuối
cùng
Lƣợng dùng (µL)
- Taq DNA polymerase 2X-preMix - MgCl2100mM - BAR3 5µM - BAR4 5µM - DNA khuôn - Nước cất vô trùng 2X 100mM 5µM 5µM 0.5-5 (ng/µL) 12.5 0.5 2.5 2.5 2.0 5.0 Tổng 25µL
Thêm 2µL dung dịch DNA thử nghiệm vào mỗi ống eppendorf và trộn đều. Đặt các mẫu vào máy PCR (Eppendorf MasterCycler Personal) và chạy chương trình PCR cho cặp mồi BAR3/BAR4 (bảng 2.3).
Bảng 2.3 Chương trình khuếch đại cặp mồi BAR3/BAR4
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian
(phút) Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 950C 3 - Biến tính - Bắt cặp - Kéo dài 950C 600C 720C 1 1 1 40 Kết thúc 72 0 C 40C 7 ∞
Sản phẩm khuếch đại bằng PCR sẽ được phân tích và kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2% trong dung dịch TAE 1X dưới hiệu điện thế 50V/60 phút. Gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide và phát hiện các vạch trên đèn UV. Kích thước của các vạch được xác định bằng cách so sánh với thang chuẩn.
Chỉ tiêu theo dõi
Quan sát các vạch xuất hiện dưới đèn UV.
So sánh các vạch của các giếng với thang chuẩn 100bp Plus DNA.
2.2.6 Khảo sát khả năng kháng chịu với PPT của PLB Dendrobium CV.
BURANA WHITE chuyển gen
Mục tiêu
Xác định nồng độ PPT tối đa mà các mẫu PLB chuyển gen còn sống được.
Phương pháp thực hiện
Các mẫu PLB sau quá trình tái sinh sẽ được sử dụng để thử nghiệm tiếp khả năng kháng chịu với PPT.
Các mẫu PLB được cắt nhỏ với kích thước khoảng 3-4mm và đặt trên các đĩa petri chứa môi trường MS có bổ sung PPT với các nồng độ sau: 0, 1, 2, 3, 4, 5 mg/L.
Mỗi đĩa gồm 20 mẫu. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Cấy chuyền các mẫu PLB sau mỗi 2 tuần.
PPT (mg/L) 0 1 2 3 4 5
Nghiệm thức (K0) (K1) (K2) (K3) (K4) (K5)
Môi trường MS + NAA 0.5mg/L + BA 0.5mg/L
Mẫu PLB chuyển gen
Chỉ tiêu theo dõi
Ghi nhận số PLB sống và bị hoại tử hoặc chết sau 3 tuần. Ghi nhận khả năng tăng trưởng của PLB.
Từ đó, thống kê xác định nồng độ PPT tối đa mà PLB chuyển gen còn sống và phát triển được.
Chương 3
KẾT QUẢ BIỆN LUẬN
3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của PPT đến khả năng sống của PLB Dendrobium CV.
BURANA WHITE
Plasmid được sử dụng trong trong quá trình chuyển gen là pGII0229 TRgus cpl48 luc từ A. tumefaciens có mang gen bar. Đây là gen có khả năng kháng được thuốc diệt cỏ Phosphinothricin (PPT). Thông thường, đối với lan Dendrobium CV. BURANA WHITE chưa mang gen bar thì sẽ không có khả năng kháng được thuốc diệt cỏ PPT. Do đó, sự hiện diện của PPT sẽ giết chết các PLB. Còn đối với những PLB đã chuyển gen thành công, tức là những PLB đã có mang gen bar thì chúng sẽ có khả năng sống sót trên môi trường có bổ sung PPT. Tuy nhiên, nếu nồng độ PPT chưa đạt tới ngưỡng nhất định thì một số PLB chưa mang gen bar vẫn có khả năng sống sót trên môi trường có bổ sung PPT. Do vậy, cần tìm một nồng độ PPT tối thiểu mà tại đó tất cả các PLB chưa mang gen bar đều không thể sống sót được cho dù được nuôi trên môi trường thuận lợi nhất.
Dựa vào tỷ lệ các mẫu PLB chết và tỷ lệ các mẫu PLB sống, giúp nhận biết được ảnh hưởng của PPT lên khả năng sống của các mẫu cấy PLB.
Bảng 3.1 Tỷ lệ PLB còn sống sau 6 tuần nuôi cấy dưới ảnh hưởng của PPT
Nồng độ PPT (mg/L) Tỷ lệ mẫu sống 0.0 100.00% 0.5 92.59% 1.0 77.78% 2.0 40.74% 2.5 7.41% 3.0 0.00% 4.0 0.00% 5.0 0.00%
Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE còn sống sau 6 tuần nuôi cấy dưới ảnh hưởng của PPT
Dựa vào kết quả thử nghiệm với PPT (bảng 3.1 hoặc biểu đồ 3.1), cho thấy:
Các mẫu PLB trên môi trường không có bổ sung PPT (ĐC - đối chứng) sau 2 tuần vẫn xanh tốt. Sau 4 tuần, các PLB lớn dần lên và bắt đầu xuất hiện các PLB nhỏ, tạo ra các cụm PLB tăng dần về kích thước cũng như số lượng.
Các mẫu PLB trên môi trường có bổ sung PPT sau 2 tuần nuôi cấy đã thấy xuất hiện hiện tượng các PLB bắt đầu hóa nâu, vàng và chết. Sau 6 tuần nuôi cấy, các mẫu PLB ở nồng độ 3, 4, 5mg/L hoàn toàn hóa nâu, hóa đen và chết hoàn toàn (100% chết). Các mẫu ở trên môi trường có PPT ở các nồng độ khác có biểu hiện bị ức chế hình thành PLB. Theo bảng trên, nồng độ PPT tối thiểu gây chết hoàn toàn mẫu PLB là 3mg/L. Như vậy, PPT đã có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sống và sự hình thành PLB của các mẫu PLB chưa chuyển nạp gen.
Kết quả cũng cho thấy, lan Dendrobium CV. BURANA WHITE cực kỳ rất nhạy cảm với thuốc diệt cỏ PPT. Chỉ với một nồng độ thấp (3mg/L) cũng đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng sống của các PLB.
Như vậy, nồng độ PPT 3mg/L sẽ được chọn để làm tác nhân chọn lọc các PLB chuyển nạp gen thành công, bởi vì nồng độ này sẽ giết chết hoàn toàn các PLB chưa chuyển gen.
Hình 3.1 Ảnh hưởng của PPT lên khả năng sống của PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE sau 6 tuần nuôi cấy
5.0mg/L 4.0mg/L 1.0mg/L 0.5mg/L 0.0mg/L 3.0mg/L 2.5mg/L 2.0mg/L
3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của kháng sinh cefotaxim và meropenem lên khả
năng sống của PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE và sự tái nhiễm
khuẩn qua đồng nuôi cấy
Trong quá trình chuyển gen, các PLB được ủ chung với vi khuẩn A. tumefaciens. Do đó, cần phải loại bỏ và ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn, gây cản trở sự phát triển của tế bào và làm chết các mô chuyển gen, để tạo điều kiện cho các PLB chuyển gen phát triển một cách thuận lợi nhất.
Vì sử dụng kháng sinh để diệt vi khuẩn có thể gây ức chế sự phân chia của tế bào và sự tái sinh của tế bào, nên cần phải khảo sát các loại kháng sinh, để tìm ra kháng sinh nào diệt khuẩn tốt nhất với nồng độ thấp nhất mà ít gây ảnh hưởng đến sự phát triển của các PLB, để từ đó nâng cao hiệu suất chuyển gen.
Trong những năm gần đây, đã có một số nghiên cứu sử dụng một số loại kháng sinh thế hệ mới là moxalactam và meropenem để diệt vi khuẩn A. tumefaciens với nồng độ rất thấp. Trong khi các kháng sinh thế hệ cũ như cefotaxim, carbenicilin, timentin... thường sử dụng với nồng độ rất cao khoảng 200-500mg/L thì moxalactam và meropenem chỉ cần sử dụng từ 5-50mg/L là đã loại bỏ hầu hết các vi khuẩn gram âm, đặc biệt là A. tumefaciens. Không những được sử dụng với nồng độ thấp để diệt khuẩn, các loại kháng sinh thế hệ mới này còn ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của tế bào thực vật. Nhờ vậy mà sự tái sinh của mô cấy sau chuyển gen trên môi trường chọn lọc ít bị hạn chế hơn, và từ đó hiệu suất chuyển gen cũng được nâng cao.
Việc sử dụng kháng sinh ở nồng độ nào là tùy vào từng chủng vi khuẩn. Trong thí nghiệm này, chủng vi khuẩn được sử dụng là A. tumefaciens EHA101. Chủng này được sử dụng để khảo sát sự tái nhiễm khuẩn trên các môi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim và meropenem với những nồng độ khác nhau.
Thử nghiệm sự ảnh hưởng của nồng độ cefotaxim và meropenem lên PLB
Dendrobium CV. BURANA WHITE được ghi nhận ở bảng 3.2 hoặc biểu đồ 3.2 và biểu đồ 3.3.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cefotaxim và meropenem lên khả năng sống của PLB và sự tái nhiễm khuẩn qua đồng nuôi cấy sau 6 tuần
Kháng sinh Nồng độ
(mg/L) % mẫu sống Sự tái nhiễm khuẩn
Cefotaxim 0 95.00% Có 300 98.33% Có 400 51.67% Không 500 36.67% Không 600 11.67% Không 700 3.33% Không Meropenem 0 98.33% Có 5 100.00% Có 10 85.00% Có 15 63.33% Không 20 36.67% Không 25 16.67% Không
Ở nồng độ dưới 400mg/L, sự ảnh hưởng của cefotaxim lên khả năng sống và hình thành PLB không đáng kể. Tỷ lệ mẫu PLB sống khá cao (trên 95%). Tuy nhiên, sự tái nhiễm khuẩn lại xảy ra ở mật độ thấp (4-5 mẫu/tổng số mẫu) trong quá trình đồng nuôi cấy.
Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE còn sống sau 6 tuần nuôi cấy dưới ảnh hưởng của cefotaxim
Khi nồng độ cefotaxim tăng đến 400mg/L, thì bắt đầu xuất hiện các PLB hóa nâu và dần chết đi, hơn nữa sự tạo PLB mới cũng bắt đầu giảm. Như vậy, tại nồng độ này, cefotaxim đã ảnh hưởng đến khả năng sống và tạo PLB mới. Tuy nhiên, không thấy sự tái nhiễm khuẩn xảy ra ở nồng độ này.
Khi nồng độ cefotaxim tiếp tục dần tăng lên đến 700mg/L, thì khả năng sống của các PLB càng giảm mạnh và hiện tượng hóa nâu cũng tăng lên rất nhanh mặc dù sự tái nhiễm khuẩn không hề xảy ra.
Như vậy, nồng độ 400mg/L là nồng độ tối thiểu mà cefotaxim ức chế hoàn toàn vi khuẩn. Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu PLB sống không cao (51.67%).
Còn đối với kháng sinh meropenem, ở nồng độ 5 mg/L, các mẫu PLB có khả năng sống và hình thành PLB mới tốt. Sự tạo PLB cũng diễn ra bình thường, không thấy dấu hiệu bị ức chế so với đối chứng (nồng độ meropenem 0 mg/L). Tuy nhiên, vẫn ghi nhận là có sự tái nhiễm khuẩn.
Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE còn sống sau 6 tuần nuôi cấy dưới ảnh hưởng của meropenem
Ở nồng độ 10mg/L (meropenem), các PLB bắt đầu xuất hiện hiện tượng hóa nâu, hóa vàng và chết đi. Các PLB còn sống sót vẫn hình thành PLB tốt. Tuy nhiên, sự tái nhiễm khuẩn vẫn xảy ra.
Ở nồng độ 15mg/L (meropenem), sự hóa nâu và sự chết của các PLB ngày một tăng lên. Phần trăm mẫu PLB còn sống khoảng 63.33%. Tuy nhiên, ở nồng độ này, không thấy sự tái nhiễm khuẩn. Khi nồng độ meropenem càng tăng lên đến 25mg/L, thì tỷ lệ mẫu PLB chết càng cao mặc dù sự tái nhiễm khuẩn không xảy ra.
Theo một vài nghiên cứu đã công bố, thì kết quả khảo sát ở trên khá phù hợp, meropenem ức chế được vi khuẩn và ít ảnh hưởng đến sự sống và sự tái sinh của PLB chuyển gen ở nồng độ khoảng 5-25mg/L (Ogawa và Mii, 2005, 2007) [47][48].
Theo kết quả khảo sát trên, để diệt khuẩn hoàn toàn và ít ảnh hưởng đến sự sống và tái sinh của PLB, thì đối với cefotaxim phải cần nồng độ 400mg/L, trong khi meropenem chỉ cần 15mg/L. Đồng thời, về liều lượng dùng thì meropenem thấp hơn rất nhiều so với cefotaxim (15mg/L so với 400mg/L). Còn về khả năng ảnh hưởng đến sức sống và khả năng tái sinh của PLB thì meropenem tỏ ra trội hơn (63.33% > 51.67%). Như vậy, kháng sinh sẽ được chọn để diệt khuẩn trong những thí nghiệm tiếp theo sẽ là meropenem với nồng độ sử dụng là 15mg/L.
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cefotaxim lên khả năng sống của PLB
Dendrobium CV. BURANA WHITE sau 6 tuần nuôi cấy