Khi nghiên cứu quá trình vận chuyển và sát nhập T-DNA vào bộ gen DNA thực vật, thấy có 3 sự kiện xảy ra có thể áp dụng vào công nghệ chuyển gen ở thực vật:
Thứ nhất là sự hình thành khối u là do T-DNA từ plasmid Ti gắn chèn vào bộ gen thực vật và được biểu hiện.
Thứ hai là các gen trên vùng T-DNA chỉ được phiên mã và không có vai trò gì trong quá trình vận chuyển T-DNA.
Thứ ba là bất kỳ đoạn DNA nào nằm giữa 2 bờ (trái và phải) của T-DNA cũng đều được chuyển vào tế bào thực vật.
Dựa vào hiện tượng này, các nhà khoa học đã phát triển các plasmid nhân tạo và các chủng vi khuẩn nhân tạo để biến chúng trở thành công cụ chuyển gen trên thực vật dù là cây Một lá mầm. Do kích thức plasmid Ti nguyên thủy rất lớn (200kb) nên rất cồng kềnh trong vận chuyển, vả lại không có vùng MCS (multicoloning site), không tự sao chép trong E.coli và gây khối u cho cây nên người ta đã cải tiến plasmid bằng cách loại bỏ các gen không cần thiết, chèn thêm các gen chọn lọc, gen chỉ thị, gen mục tiêu và các promoter mạnh thích hợp. Đặc biệt là thu gọn được kích thước plasmid và thêm vào các vị trí của các enzym cắt giới hạn. Có hai loại vector plasmid nhân tạo (hình 1.18) thường được chuyển vào trong A. tumefaciens:
Vector đồng nhập (co-intergrated vector): gen ngoại lai được gắn vào plasmid chung với vùng gen vir (Ruvkin và Ausubel, 1979) và nằm bất kỳ đâu trên vùng T-DNA. Tuy nhiên, loại vector này có kích thước lớn và cồng kềnh, trở ngại trong vấn đề vận chuyển.
Vector hai nguồn (binary vector): gen ngoại lai được gắn vào một vùng DNA trên một khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) riêng, không nằm trong vùng gen vir. Do đó, khắc phục được sự cồng kềnh của vector đồng nhập. Vì vậy, loại vector này được sử dụng rất phổ biến [37].
Hình 1.18 Hệ thống các vector nhân tạo. Hình A là vector đồng nhập, hình B là vector hai nguồn.
1.11 So sánh phƣơng pháp bắn gen với phƣơng pháp chuyển gen bằng vi
khuẩn A. tumefaciens
Chuyển gen bằng A. tumefaciens Bắn gen
- Hiệu suất chuyển gen cao
- Gen mục tiêu ít bị đào thải, tồn tại trong bộ gen thực vật khá bền vững. - Số bản sao DNA gắn vào bộ gen thực vật thường thấp, giảm sự bất ổn của gen chuyển.
- Thời gian ngắn hơn. - Giá thành thấp.
- Ít hình thành cây thể khảm.
- Có thể gây khối u ở Khỏa tử và cây Hai lá mầm nhưng khó gây khối u cho cây Một lá mầm.
- Chỉ đưa gen mục tiêu vào nhân.
- Hiệu suất chuyển gen còn rất thấp. - Gen mục tiêu có thể bị đào thải.
- Số bản sao DNA gắn vào bộ gen thực vật thường rất cao.
- Thời gian lâu hơn. - Giá thành cao.
- Dễ hình thành thể khảm.
- Áp dụng được với mọi loài, kể cả ở cây Một lá mầm.
- Có thể đưa gen vào cả nhân, ty thể và lục lạp thực vật.
1.12 Cấu trúc của gen chuyển nạp 1.12.1 Promoter và terminator 1.12.1 Promoter và terminator
Bất kỳ một gen nào muốn biểu hiện thì phải có promoter điều khiển quá trình phiên mã và dịch mã của gen đó. Promoter thường được sử dụng phổ biến nhất là promoter CaMV35S (từ Cauliflower Moisac Virus). Đây là promoter mạnh, có chứa các trình tự tăng cường Enhancer giúp thúc đẩy quá trình phiên mã, dịch mã diễn ra nhanh hơn, đặc biệt là ở cây Hai lá mầm.
Terminator là trình tự kết thúc, giúp gen được chuyển kết thúc đúng vị trí và không tạo ra các protein khảm với các protein từ thực vật. Một trong số những trình tự terminator được sử dụng phổ biến là terminator nos (từ gen tổng hợp nopaline của plasmid Ti trong vi khuẩn A. tumefaciens) [2].
1.12.2 Gen chọn lọc (selectable gene) [2][18][46]
Tất cả các vector chuyển gen phải có ít nhất một gen chọn lọc để giúp sàng lọc được dòng chuyển gen thành công. Các gen này thường mã hóa cho một enzym có khả năng khử độc tính của chất chọn lọc trong quá trình chuyển hóa. Các gen này còn được dùng để phân tích trong bộ gen cây chuyển gen có tồn tại gen này hay không và chúng ở đâu trong bộ gen đó.
Điều kiện chọn một gen chọn lọc để gắn vào plasmid:
Sự biểu hiện của gen chọn lọc không làm gián đoạn quá trình chuyển hóa của vật chủ.
Sự biểu hiện của gen chọn lọc có thể ức chế được tác nhân chọn lọc, giúp cây chuyển gen sống và phân biệt được với cây không chuyển gen. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tế bào mang gen chuyển ảnh hưởng ít nhất đến sự sinh trưởng và phát triển của cây chủ.
Những gen chọn lọc thường được sử dụng là các gen mã hóa cho enzym hygromycin phosphotransferase (hpt), phosphinothricin acetyltransferase (pat hay
bar) hay neomycin phosphotransferase (nptII). Ngoài ra, gần đây gen pmi mã hóa cho enzym phosphomannose isomerase cũng được sử dụng nhờ phản ứng huỳnh quang trong môi trường có tác nhân chọn lọc là đường mannose [50]. Tác nhân này không phải là chất kháng sinh, cũng không phải là thuốc diệt cỏ nên trong tương lai sẽ có tiềm năng rất lớn. Còn gen bar là gen được phân lập từ Streptomyces hygroscopius, mã hóa cho enzym phosphinothricin acetyltransferase (PAT). Enzym này có thể bất hoạt PPT bằng cách acetyl hóa nhóm amin của PPT. Chất này ức chế mạnh mẽ enzym Glutamin Synthase (De Block, 1987) hoặc enzym EPSP Synthase (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase). Đây là những enzym liên quan đến con đường tổng hợp amino acid (glutamin, tryptophan, tyrosine...) cần thiết cho sự phát triển của tế bào thực vật. Nếu các enzym này bị bất hoạt, tế bào thực vật sẽ tích lũy lượng amonia (NH4+) ngày càng cao, gây độc cho tế bào và mô cây sẽ chết dần. Thực vật mang gen bar sẽ có khả năng kháng được PPT.
1.12.3 Gen chỉ thị (reporter gene) [46][18]
Gen chỉ thị giúp nhận biết được thể chuyển gen và xác định sự biểu hiện tạm thời của gen ngoại lai. Gen chỉ thị thường được sử dụng là gen gus mã hóa cho enzym β-glucuronidase, gen phát sáng gfp hay gen cat mã hóa cho enzym chloramphenicol acetyltransferase (CAT), gen luc mã hóa cho enzym luciferase (từ đom đóm). Và gần đây là gen Ds-Red (phân lập từ bọt biển Discosoma sp.), phát sáng đỏ ngay cả ở ngoài sáng bình thường. Các gen này cũng phải thỏa:
Sản phẩm tạo ra là duy nhất, không độc đối với tế bào thực vật.
Enzym phải có tính ổn định cao sau giai đoạn dịch mã.
Cho sản phẩm có độ nhạy cao, dễ định tính và không quá đắt.
Phải hòa hợp với sự dịch mã của các gen khác.
Gen gusA (uidA) là gen chỉ thị được sử dụng rất phổ biến. Gen này có nguồn gốc từ gen uidA của E.coli, mã hóa cho enzym β-glucuronidase. Gen gus được tách ra và gắn vào plasmid của vi khuẩn Agrobacterium. Enzym này xúc tác phản ứng chuyển cơ chất (X-Gluc) thành acid glucuronic, một phần của acid này được tách ra để tổng hợp một indoxyl không màu. Chất này được oxy hóa tiếp để tạo thành một chất rắn không tan có màu xanh chàm đặc trưng (hình 1.19). Sản phẩm GUS có thể phát hiện trong khoảng 8 giờ sau khi DNA được chuyển vào, và kéo dài khoảng 3 ngày, nhưng tốt nhất là khoảng 24 giờ đến 36 giờ [2].
1.13 Một số phƣơng pháp phát hiện gen chuyển 1.13.1 Phƣơng pháp thử GUS
Phương pháp này dùng để kiểm tra sự hiện diện của gen chỉ thị gusA. Phương pháp thử GUS do Jefferson đề xuất vào năm 1987. Thử nghiệm GUS rất nhạy, có thể định tính lẫn định lượng. Trong tự nhiên, β-glucuronidase không tồn tại trong thực vật. Do đó, đây là gen chỉ chị rất tốt trong công nghệ chuyển gen ở thực vật. Ngoài ra, sản phẩm của gen gus rất bền, ít bị ảnh hưởng bởi acid. Có thể thử GUS ngay trên mô hay tế bào thực vật bằng cách cắt mô, nhuộm với cơ chất X-Gluc và theo dõi màu trên kính hiển vi. Cũng có thể định lượng bằng cách so màu trên quang phổ huỳnh quang. Cơ chất được sử dụng trong thử nghiệm GUS là 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc). Chất này cho màu xanh chàm khi có sự hiện diện của enzym β-glucuronidase (xem hình 1.19) [2].
1.13.2 Phƣơng pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ (PPT) của cây tái sinh trong in vitro
Các mô cấy sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn mang gen mục tiêu (gen kháng khánh sinh hay gen kháng thuốc diệt cỏ) sẽ được chuyển sang môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh hoặc thuốc diệt cỏ với nồng độ tùy vào loài. Theo thời gian, các tế bào thực vật có mang gen mục tiêu sẽ sống được bình thường trên môi trường đó và được tái sinh, trong khi các tế bào không mang gen mục tiêu sẽ chết dần. Có thể sử dụng bộ phận nào đó, chẳng hạn như đoạn thân, lá, rễ, lát cắt mỏng, PLB... để kiểm tra trên môi trường có bổ sung tác nhân chọn lọc. Trong trường hợp này, mẫu đối chứng sẽ chết, còn mẫu chuyển gen sẽ phát triển bình thường.
1.13.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật này do Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Thực chất của kỹ thuật này là khuếch đại một số lượng rất lớn bản sao từ một trình tự nào đó có sẵn.
Kỹ thuật này dựa vào hoạt tính tổng hợp theo chiều 5’-3’ của enzym DNA polymerase. Enzym này sẽ tiến hành tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn nếu như có sự hiện diện của các mồi chuyên biệt. Các mồi này là những đoạn DNA ngắn, bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn. Từ đây, DNA polymerase sẽ kéo dài các đoạn mồi này ra theo chiều 5’-3’ để hình thành nên mạch DNA mới. Nếu cặp mồi này bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA nào đó thì chỉ thu được đọan DNA mới nằm giữa hai đoạn mồi này. Do đó, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, chỉ cần biết thông tin trình tự giữa hai đầu trình tự cần khuếch đại. Cặp mồi dùng trong PCR gồm một mồi xuôi và một mồi ngược. Phản ứng PCR là phản ứng gồm nhiều chu kỳ lặp lại. Mỗi chu kỳ PCR gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: nhiệt độ ở giai đoạn này phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của DNA (Tm), thường là 950C, để tách sợi đôi DNA thành các sợi đơn DNA.
Giai đoạn lai: nhiệt độ ở giai đoạn này thấp hơn nhiệt độ Tm, thường dao động trong khoảng 400
C-700C, để mồi bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí tương đồng.
Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ ở giai đoạn này thường là 720
C (tối ưu cho
Taq polymerase), để enzym DNA polymerase tiến hành kéo dài mạch DNA mới từ các mồi đã bắt cặp với mạch khuôn theo chiều 5’-3’.
Ở thực vật, phản ứng PCR thường thực hiện trong khoảng 40-50 chu kỳ. Sau 30 chu kỳ, số lượng bản sao được khuếch đại vào khoảng 106 [5].
Đánh giá kết quả chuyển gen thực vật
Để đánh giá kết quả chuyển gen, trước hết tách chiết DNA, sau đó thiết kế các cặp mồi chuyên biệt để khuếch đại gen mục tiêu. Sau khi thực hiện xong PCR, sản phẩm khuếch đại được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Nguyên tắc của điện di là dựa trên kích thước, cấu hình và sự tích điện trên phân tử acid nucleic. Do nucleic acid tích điện âm trên khắp bề mặt nên dưới tác dụng của
điện trường, sản phẩm khuếch đại sẽ di chuyển về phía cực dương. Tùy vào kích thước sản phẩm PCR mà chọn nồng độ gel thích hợp.
Bảng 1.1 Mối liên hệ giữa nồng độ gel và kích thước đoạn DNA.
% gel agarose Kích thƣớc đoạn
cần phân tách (kb) 0.6 - 0.8 0.9 – 1.2 1.2 – 1.5 1.0 – 20.0 0.5 – 0.7 0.2 – 5.0 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các nucleic acid trong gel sẽ phát huỳnh quang khi chiếu tia UV do có ethidium bromide. Chất này chỉ xen vào giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang khi chiếu tia UV.
Ngoài ra, còn dùng thang DNA chuẩn (tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau) để ước lượng kích thước của sản phẩm khuếch đại.
1.14 Tình hình nghiên cứu thực vật chuyển gen
1.14.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen lan Dendrobium trên thế giới
Hiện nay đa số các nghiên cứu về chuyển gen chủ yếu tập trung vào việc cải thiện hiệu suất chuyển gen [56], hiệu quả tái sinh và cải thiện các đặc tính của lan chẳng hạn như kéo dài tuổi thọ, thay đổi màu sắc của hoa lan, hoa lâu tàn... Bằng cách chuyển gen antisense acc oxidase (hoặc gen acc) mã hóa cho enzym ACC Oxidase để ức chế enzym ACC synthase liên quan đến sự tổng hợp ethylen làm hoa lan chóng tàn. Nhờ đó, giúp hoa lan lâu tàn hơn [17][72].
Subramaniam và cộng sự (2009), đã khảo sát các yếu tố (nồng độ acetosyringone, thời gian đồng nuôi cấy, AgNO3, nồng độ vi khuẩn...) để tối ưu hóa quy trình chuyển gen lan Dendrobium Savin White. Phương pháp sử dụng trong nghiên cứu này là dùng vi khuẩn A. tumefaciens, và mục tiêu là theo dõi sự biểu hiện của gen gusA.
Để thay đổi màu sắc của hoa lan Dendrobium nobile, Ching D.P và Mii M. (2012) cũng đã sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens để chuyển gen flavonoid-3’,5’- hydroxylase (F3’5’H) mã hóa cho enzym flavonoid-3’,5’-hydroxylase (F3’5’H), để rồi sinh tổng hợp nên chất 3’,5’-hydroxylated anthocyanins cần cho sự biểu hiện màu xanh của hoa lan [39].
Bảng 1.2 Một số nghiên cứu chuyển gen ở thực vật trên thế giới [15] [16] [27] [33] [40] [41] [43] [59] [63] [66] Đối tƣợng Phƣơng pháp sử dụng Gen chuyển Hiệu suất Tác giả Mô sẹo
Oryza sativa Agrobacterium cry1Ac 2%
Kim E.H. và cộng sự (2009)
Mô sẹo phôi
Hordeum vulgare Bắn gen AtNDPK2 0.15%
Um M.K. và cộng sự (2007) Chồi nách Saccharum sp. Agrobacterium nptII, bar, gusA 50% Manickavasagam M. và cộng sự (2004) Mô sẹo
Sorghum bicolor Agrobacterium Man, gfp 8.3%
Gurel S. và cộng sự (2009)
Mô sẹo phôi
Triticum sp. Agrobacterium bar, gusA 9.7%
Wu H., Doherty A., và Jones
H.D. (2008)
Mô sẹo phôi
Zea mays Bắn gen
gusA,
hptII 31%
Lowe B.A. và cộng sự (2009)
Nốt mầm
Arachis hypogea Agrobacterium gusA 38%
Anuradha T.S. và cộng sự (2006)
Lá trường thành
Brassica oleracea Bắn gen cry1Ab 11.1%
Liu C.-W. và cộng sự (2008) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phôi soma
Glycine max Bắn gen Os-mALS 60%
Tougou M. và cộng sự (2009) Phôi soma Gossypium hirsutum SCW* AVP1, nptII 64% Asad S. và cộng sự. (2008) * SCW - Silicon-Carbide-Whiskers-mediated transformation
1.14.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen thực vật ở Việt Nam
Ở các kỳ Hội nghị Khoa học và Công nghệ thường niên, các bài báo về chuyển gen nói chung và các bài báo chuyển gen ở thực vật nói riêng tuy ngày càng tăng về số lượng lẫn chất lượng nhưng so với các nước khác trên thế giới, thì vẫn còn thua xa mặc dù công nghệ chuyển gen đã có từ lâu. Tuy nhiên, việc triển khai công nghệ chuyển gen vào thực vật để áp dụng vào sản xuất đại trà vẫn chưa được phép mà chỉ được khảo nghiệm chuyển gen trong những khu vực được phép và bị giới hạn.
Gần đây, Việt Nam cũng đã bắt đầu quan tâm nhiều đến lĩnh vực công nghệ sinh học và cũng đã đầu tư khá nhiều nên đã có khá nhiều công trình về chuyển gen ở thực vật và cũng đạt được những thành tựu nhất định.
Bảng 1.3 Một số nghiên cứu chuyển gen ở thực vật tại Việt Nam [1][9][10][12].
Đối tƣợng Phƣơng pháp sử dụng Plasmid và gen Tác nhân chọn lọc Tác giả PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE Bắn gen pITB-DsRED (Ds-Red) pITB-BAR (bar) PPT Nguyễn Hữu Hổ và cộng sự (2012) Chồi non Manihot esculenta Crantz Bắn gen pBAR-GUS (bar, gus) PPT Bùi Lan Anh và cộng sự (2008) Lá Chrysanthemum morifolum L. Agrobacterium pVDH396 (hpt, gus,ipt) Hygromycin Phan Tường Lộc (2007) Lá mầm Brassica oleracea var. capitata Agrobacterium pVDH396 (hpt, gus,ipt) Hygromycin Bùi Đình Thạch và cộng sự (2007) Lá dâu tây Fragaria vesca L. Agrobacterium pCAMBIA2301
(nptII, gusA) Kanamycin
Mai Trường và
cộng sự (2007)
Mô sẹo bắp
Zea mays L. Agrobacterium
pITB- FERRITIN (ferritin, hpt, gus) ferritin Nguyễn Thị Phương Nam (2007) PLB Dendrobium CV. BURANA WHITE Agrobacterium pITB239-GFP (hpt, gfp) Hygromycin Võ Phan Mi Sa (2007) PLB Phalaenopsis Agrobacterium