2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2.3 Thử nghiệm quy trình biến nạp gen vào lan Dendrobium CV BURANA
WHITE bằng vi khuẩn A. tumefaciens
Mục tiêu
Xác định nồng độ Acetosyringone (AS) tối ưu để cảm ứng vi khuẩn chuyển gen. Xác định thời gian đồng nuôi cấy tối ưu giữa các mẫu PLB với vi khuẩn A. tumefaciens để vi khuẩn thực hiện chuyển gen.
Phương pháp thực hiện
Chuẩn bị dịch vi khuẩn A. tumefaciens
Vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy lắc trong 20ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin 50mg/L và rifampicin 50mg/L qua đêm, ở 220C.
Ly tâm, thu sinh khối vi khuẩn và pha loãng bằng dung dịch MS vô trùng sao cho chỉ số OD600 cuối cùng là 0,8 (tương đương 8.108 tế bào/ml).
Chuẩn bị mẫu
Các PLB còn xanh tươi, khỏe mạnh được cắt nhỏ khoảng 3-4mm.
Đặt các mẫu PLB đã cắt nhỏ vào các ống nghiệm sạch, vô trùng. Mỗi ống nghiệm gồm 20 mẫu.
Đồng nuôi cấy các mẫu PLB với dịch vi khuẩn A. tumefaciens
Thêm vào dịch huyền phù vi khuẩn một lượng AS sao cho nồng độ cuối cùng là 0M, 25M, 50M, 75M , 100M, 125M, 150M, 175M và 200M, lắc đều và để yên trong 30 phút để AS tác dụng lên vi khuẩn.
AS (M) 0 25 50 75 100 125 150 175 200
Nghiệm thức (0) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) Môi trường MS(1/2) + 0.5mg/L NAA + 0.5mg/L BA
Mẫu cấy PLB
Sau đó, cho 5ml dịch vi khuẩn sau khi đã hoạt hóa vào trong ống nghiệm có chứa PLB ở trên và để yên khoảng 1 giờ.
Sau 1 giờ, dùng giấy thấm vô trùng thấm khô bớt dịch vi khuẩn bám trên các PLB, và đặt lên đĩa petri chứa môi trường rắn MS có bổ sung NAA 0.5mg/L và BA 0.5mg/L.
Tất cả các đĩa được ủ trong tối ở 220C.
Mỗi đĩa gồm 20 mẫu. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Sau 3, 5, 7 ngày đồng nuôi cấy, lấy ra 5 mẫu ở mỗi nghiệm thức mang đi thử GUS (lấy cùng với các PLB không có ủ với dịch vi khuẩn để làm mẫu đối chứng).
* Phương pháp thử GUS
Đặt các mẫu PLB thử nghiệm vào trong các eppendorf 2ml sạch và thêm vào một lượng thuốc thử GUS (phụ lục 3) vừa đủ ngập mẫu.
Ủ ở 370
C trong bể ổn nhiệt trong khoảng 16-18 giờ. Hút bỏ dung dịch thuốc thử và rửa mẫu bằng ethanol 96%
Hiệu suất chuyển gen = Tổng số PLB tái sinh/Tổng số PLB thử nghiệm Rửa nhiều lần, mỗi lần cách nhau vài giờ để loại hết diệp lục tố, cho đến khi các mẫu thử nghiệm hoàn toàn mất màu xanh diệp lục tố.
Chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ mẫu PLB còn sống.
Phần trăm mẫu dương tính với thuốc thử GUS (có màu xanh chàm).
So sánh mức độ phân bố và độ đậm của màu xanh chàm trên các mẫu PLB.