Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học lớn. Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA). Real-time PCR định lượng còn được biết như là qPCR. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ.
2. Phân tích tổng quát một phản ứng real-time PCR
Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong khuếch đại mẫu (Hình 3.9). Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại trong tube, được trình bày ở trục y.
Đường cong khuếch đại có 2 pha, một pha hàm mũ (exponential phase) được tiếp theo bởi một pha ổn định (plateau phase). Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sản phẩm PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng
làm cho một hoặc nhiều thành phần bị hạn chế. Ở điểm này phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn định (các chu kỳ 28-40, Hình 3.9).
Hình 3.9. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền (baseline).
Đầu tiên, tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền (background), và việc tăng tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1- 18, Hình 3.9) cho dù sản phẩm tích lũy theo hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, CT). Do giá trị CT được đo trong pha hàm mũ khi các tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên real-time qPCR có thể được sử dụng để tính toán chính xác và tin cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng.
CT được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện ở lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài chu kỳ khuếch đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên background. Vì vậy, phản ứng sẽ có CT thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn mẫu lúc bắt đầu phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng trên background. Vì vậy, 0 10 20 30 40 Pha hàm mũ Giá trị CT Đường ngưỡng Pha ổn định 0.3 0.2 0.1 0
phản ứng sẽ có CT cao hoặc muộn. Các dạng quan hệ này là cơ sở cho hướng định lượng của real-time PCR.
3. Một số ứng dụng chính của real-time PCR
- Nghiên cứu biểu hiện gen. Xác định sự hoạt động của gen và định
lượng mức độ biểu hiện của nó thông qua RNA bằng kỹ thuật RT-PCR.