Enzyme l 4 xâm nhiễm trong E. coli
enzyme này .
1. Bacteriophage T4 DNA ligase
(Bacteriophage T4-infected E. coli)
-
5’-PO4 của một phân tử DNA khác. DNA ligase có tác dụng cho cả trường hợp đầu so le lẫn đầu bằng, tuy nhiên đối với đầu bằng enzyme đòi hỏi nồng độ cao hơn và điều kiện phản ứng cũng khác.
Cơ chất
Gắn các đầu dính hoặc điểm đứt (nick)
5’
...pApCpGOH
3’... TpGpCpTpTpApAp
pApApTpTpCpGpT ...3’
HOGpCpAp...5’
(a) Các phân tử DNA sợi đôi có đầu dính bổ sung (b) nicked: DNA enzyme ATP, Mg2+ 5’ ...pApCpGpApApTpTpCpGpT...3’ 3’… TpGpCpTpTpApApGpCpAp…5’ Gắn các đầu bằng 5’ ...pCpGpAOH 3’... GpCpTp pCpGpTpA...3’ OHGpCpApTp...5’ Nồng độ cao của các DNA sợi đôi đầu bằng
mang nhóm 5’-PO4 và 3’-OH enzyme ATP, Mg2+ 5’ ...pCpGpApCpGpTpA...3’ 3’...GpCpTpGpCpApTp...5’
2. Bacteriophage T4 RNA ligase
(Bacteriophage T4-infected E. coli)
cộng 5’-PO4
3’-OH của DNA sợi đơn hoặc RNA. Do cơ chất thích hợp cho enzyme này là các phân tử nhỏ nên nó thường được dùng để đánh dấu đầu 3’ của các phân tử RNA sử dụng làm mẫu dò.
C
RNA ligase DNA hoặc RNA
5’
...pApCpGOH
3’
RNA hoặc DNA
5’
pApApTpTpC...OH 3’
DNA sợi đơn và RNA
enzyme ATP 5’
...pApCpGpApApTpTpC...OH
3’
3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase
(Bacteriophage T4-infected E. coli)
Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA. Hai loại phản ứng thường có thể xảy ra là phản ứng thuận và phản ứng trao đổi. Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate được chuyển tới đầu 5’ của DNA đã được dephosphoryl hóa (mất nhóm phosphate). Trong phản ứng trao đổi, khi có một ADP thừa, enzyme sẽ chuyển nhóm 5’ phosphate từ DNA đã được phosphoryl hóa tới ADP, DNA sau đó sẽ được phosphoryl hóa trở lại bằng cách nhận một nhóm γ-phosphate đã được đánh dấu đồng vị phóng xạ từ một phân tử [γ-32
P]ATP.
- Ứng dụng chính
+ Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ của DNA để phân tích trình tự bằng phương pháp Maxam và Gilbert (1977), dùng làm mẫu dò trong các kỹ thuật lai phân tử (xem chương 5).
+ Phosphoryl hóa các đoạn nối (linker) và các đoạn DNA không có nhóm 5’ phosphate để chuẩn bị cho phản ứng gắn trong phương pháp tạo dòng.
Phản ứng thuận
DNAOH5’ hoặc RNAOH5’
5’[32P]DNA hoặc 5’
[32P]RNA +ADP
sợi đơn mang đầu 5’-OH, RNA mang đầu 5’-OH Phản ứng trao đổi 5’ pCpGpC...3’ + ADP thừa 5’ pCpGpC...3’ + ADP + ATP
DNA sợi đơn mang đầu 5’ phosphate
4. Alkaline phosphatase
(E. coli và ruột bê)
Cả hai enzyme alkaline của vi khuẩn (bacteria alkaline phosphatase, BAP) và ruột bê (calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) đều xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA và RNA.
CPhosphatase Phosphatase 5’ pDNA hoặc 5’ pRNA 5’ OHDNA hoặc 5’
OHRNA sợi đơn và RNA
- Ứng dụng chính
+ Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu đầu 5’ bằng 32 P. enzyme enzyme [γ-32 P]ATP dithiothreitol Mg2+ enzyme [γ-32 P]ATP dithiothreitol Mg2+
+ Loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi các đoạn DNA để ngăn cản sự tự gắn. Trong kỹ thuật tạo dòng, khi một vector được mở vòng DNA bằng một RE rồi sau đó được loại bỏ nhóm 5’ phosphate thì nó không thể tự gắn lại (tự tái tạo lại vòng). Chỉ khi có đoạn DNA ngoại lai mang các đầu 5’ phosphate cần thiết được đưa vào thì phản ứng gắn giữa vector và DNA ngoại lai mới xảy ra.