+ Làm đầy đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra.
[ - 32P]dNTPs để làm đầy đầu khuyết 3’.
3’. Đầu tiên, hoạt tính exonuclease 3’ 5’ loại bỏ đầu lồi 3’ để tạo ra đầu khuyết 3’. Sau đó, nhờ sự có mặt ở nồng độ cao của một tiền chất được đánh dấu đồng vị phóng xạ, sự thoái biến bậc thang được cân bằng do sự hợp nhất của các dNTP ở đầu 3’.
.
+ Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro. 1. 4 (T4-infected E. coli) E. coli. nh polymerase enzyme Mg2+ enzyme Mg2+
5’ 3’ exonuclease 3’ 5’
phải (primer)
DNA polymerase phage T .
C5’ 3’ 5’ 3’ DNA polymerase DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi DNA 3’-OH 3’ 5’ Exonuclease ssDNA 5’pNOH
Hoạt tính trên DNA sợi đơn hơn trên DNA sợi đôi một cách đáng kể.
exonuclease
polymerase 5’ 3’
- Ứng dụng chính
+ Làm đầy hoặc đánh dấu đầu khuyết 3’ do enzyme hạn chế tạo ra. 3’, tương tự như ứng dụng của đoạn Klenow.
+ Đánh dấu các đoạn DNA để làm mẫu dò.
+ Biến đổi đầu sole của DNA sợi đôi thành đầu bằng. 1.4. Taq DNA polymerase
(Thermus aquaticus)
Thermus aquaticus
in vitro
(PCR) (xem chương 3). Taq pol thay thế cho DNA polymerase I của E. coli
do có khả năng chịu nhiệt cao phù hợp với điều kiện phản ứng của PCR, và nó có thể tổng hợp một sợi DNA dài 1 kb trong vòng 30 giây ở 72o
C.
enzyme
Mg2+
enzyme Mg2+
- Một trong những hạn chế của Taq pol là sự chính xác không cao trong quá trình sao chép của nó do bị mất cơ chế đọc sửa (hoạt tính exonuclease 3’ 5’). Enzyme Taq pol thương mại có tỷ lệ sao chép lỗi 1/10.000 nucleotide, và có thể tạo ra 16% sản phẩm PCR dài 1 kb bị đột biến trong phản ứng khuếch đại. Mặc dù có nhược điểm trên, Taq pol vẫn có thể được dùng trong các thí nghiệm đòi hỏi một trình tự di truyền chính xác (như trong tạo dòng phân tử). Tuy nhiên, kết quả cho ra một vector mang đoạn chèn (sản phẩm PCR) cần phải được kiểm tra bằng sequencing.
- Ưu điểm của Taq pol là sản xuất các đoạn gen mang hai đầu lồi A. Điều này đặc biệt hữu ích trong “TA cloning” là kỹ thuật mà vector (plasmid) được sử dụng đã có sẵn hai đầu lồi T bổ sung với hai đầu lồi A của sản phẩm PCR, nhờ đó đã làm tăng hiệu quả của phản ứng gắn.
Cơ chất 5’ 3’ DNA polymerase DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi đơn/ DNA 3’-OH
Ngoài Taq pol, nhiều DNA polymerase chịu nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với các chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Chẳng hạn: Pfu DNA polymerase (Pfu pol) được tách chiết từ Pyrococcus furiosus, thường được dùng thay cho, hoặc kết hợp, với Taq pol. Enzyme này ổn nhiệt hơn và có khả năng đọc sửa, vì thế cho tỷ lệ sao chép lỗi thấp. Hoặc Tth DNA polymerase (Tth pol), được tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn mẫu và ion Mn2+; nhưng nếu có sự hiện diện của DNA khuôn mẫu và ion Mg2+, thì Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại khuôn mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.
2. RNA polymerase (DNA-dependent RNA polymerase)
(Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium
3-infected E. coli)
enzyme
. Quá trình tổng hợp này không cần mồi.
5’ 3’ RNA polymerase RNA polymerase
dsDNA+ nrNTP RNA+ PPi promoter của bacteriophage
SP6, T3 hoặc T7
- Ứng dụng chính
+ Sản xuất RNA để làm mẫu dò.
+ Xác định trình tự của một phân tử DNA được tạo dòng trong một vector có mang promoter đặc trưng cho bacteriophage SP6, T7 hoặc T3.
+ Sản xuất một lượng lớn RNA từ một phân tử DNA được tạo dòng để nghiên cứu về cấu trúc, điều hòa và các mối tương tác của phiên bản RNA.
3. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase)
: AMV (avian myeloblastosis virus), Mo-MLV (m (retrovirus: :
- 5’ 3’. Tổng hợp DNA theo chiều 5’
(sợi đơn hoặc sợi đôi):
C5’ 3’ 5’ 3’ DNA polymerase DNAOH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi : RNAOH + ndNTP RNA-(pdN)n + nPPi một nhóm 3’-OH enzyme Mg2+ enzyme Mg2+ enzyme Mg2+
- . nuclease 5’ 3’ . Cơ chất RNase H (5’ 3’ 5’ exoribonuclease) RNA 5’...pUpCpCpGpUpA 3’ 5’...pUpC 3’ DNA 3’... ApGpGpCpApT 5’ 3’... ApGpGpCpApT 5’ + 5’pCpGpUpA3’ RNA:DNA (xem chương 6). . 4. Terminal transferase
(Tuyến ức của bê)
- . Phản ứng gắn này là ngẫu nhiên, do đó thành phần nucleotide của đầu lồi phụ thuộc vào nồng độ của bốn loại nucleotide có trong phản ứng.
Terminal transferase ssDNA OH + ndNTP DNA-(pdN)n + nPPi - : DNA 3’-OH - Ứng dụng chính enzyme Mg2+ hoặc Mn2+ enzyme
+ Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) để tạo ra đầu so le cho phân tử DNA dùng trong tạo dòng (xem chương 6).
+ Đánh dấu đầu 3’-OH của DNA trong kỹ thuật xác định trình tự gen theo Maxam và Gilbert.