1. Đặc điểm của BAC
Hệ thống nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (bacterial artificial chromosome-BAC) dựa trên cơ sở plasmid F-factor, nó có thể tái bản trong
E. coli với các đoạn chèn có kích thước lên đến 300 kb. Thể tái tổ hợp BAC được biến nạp vào trong tế bào vi khuẩn bằng xung điện (electroporation)8
. Các BAC thuận lợi cho việc xây dựng thư viện, lập bản đồ và phân tích
8
Ở điện áp cao tính thấm của màng tế bào được tăng lên sẽ giúp cho DNA ngoại lai dễ dàng đi vào bên trong.
5’ GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 3’
EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII XmaI AccI
HincII
6231 6282
genome. Chúng có hiệu suất tạo dòng cao, các đoạn chèn DNA được thao tác dễ dàng và duy trì ổn định.
Một plasmid F cơ bản bao gồm bốn vùng cần thiết có chức năng ổn định plasmid và quyết định số lượng bản sao. Đó là parA, parB, oriS và
repF. Cả hai parA và parB đều cần cho việc phân đoạn và ổn định plasmid. Ngoài ra, parB còn cần cho việc kết hợp với các F-factor khác, oriS là gốc tái bản DNA, repF mang tín hiệu của protein E cần cho quá trình tự tái bản từ oriS và quá trình kiểm soát số lượng bản sao. Trên plasmid F người ta còn bổ sung thêm gen kháng chloramphenicol (CMr hoặc Chlr) và gen lacZ
để làm marker chọn lọc các thể biến nạp. Chủng E. coli được sử dụng phổ biến cho kỹ thuật tạo dòng BAC là DH10B, đặc điểm chính của nó là mang những đột biến ngăn cản:
- Sự phân cắt DNA lạ bởi hệ enzyme nội sinh (hsd/RMS).
- Sự phân cắt DNA có gốc methyl (5’-methyl cytosine, 5’- hydromethylcytosine, gốc methyladenine) (mcrA, mcrB, mcrC và mrr).
- Sự tái tổ hợp (recA1).
Nhìn chung, các BAC vector có các đặc điểm tương tự với các plasmid vector tiêu chuẩn của E. coli, như :
- Chứa vùng ori cần thiết cho tái bản của plasmid.
- Có nguồn gốc từ một plasmid lớn trong tự nhiên: F-factor. - Có số lượng bản sao thấp (1-2 bản sao/tế bào).
- Hiệu suất biến nạp thấp đã được khắc phục bằng phương pháp xung điện để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào E. coli.
Một số ưu điểm của hệ thống BAC so với YAC: - Ổn định.
- Dễ biến nạp.
- Tốc độ sinh trưởng của vật chủ E. coli nhanh. - Dễ tinh sạch.
Vì thế, hầu hết genome người đều được phân tích trình tự bằng cách dùng các dòng BAC hơn là các dòng YAC.
2. Tạo dòng trong BAC
Quá trình tạo dòng trong BAC vector được trình bày trong hình 4.16, bao gồm các bước sau:
Hình 4.16. Tạo dòng trong BAC vector
Bảo quản riêng rẽ các dòng tái tổ hợp
SacI cosN SacI IoxP
T7 SP6 HindIII HindIII EcoRI
BamHI
lacZ XmaI SmaI NotI BglI SfiI
SalI SalI pECBACI 7,5 kb parA parB CM r oriS repF FagI HindIII Phosphatase