của DNA sợi đôi có đầu bằng hoặc đầu 3’-OH ở điểm đứt trong DNA sợi đôi
3’ phosphatase DNA sợi đôi hoặc sợi
đơn có đầu 3’ phosphate - Ứng dụng chính + 5’ pNOH 5’ P 3’ OH 5’ P Mg2+ enzyme 5’ P 3’ OH 5’ P 3’ OH 3’ OH enzyme 3’ P + 2Pi 3’ P 5’ 5’ 3’ OH 3’ OH 5’ 5’
+ Tạo ra các cấu trúc sợi đơn ở một số vùng trên phân tử DNA dùng làm cơ chất cho đoạn Klenow của DNA polymerase I (để sản xuất mẫu dò đặc trưng cho từng sợi).
+ Tạo ra các đột biến khuyết đoạn (deletion) tại các trình tự tận cùng của DNA sợi đôi mạch thẳng. Phản ứng này thường phối hợp với mung- bean nuclease hoặc nuclease S1.
Một exonuclease tương tự là nuclease BAL31, có hoạt tính exonuclease 5’ 3’ và 3’ 5’, có khả năng tạo các DNA sợi đôi đầu bằng mà không cần sự hiện diện của nuclease S1.
4. Ribonuclease (RNase A)
(Tụy bò)
Enzyme xúc tác thủy phân RNA thành các đoạn nhỏ hơn. RNase A có hoạt tính rất mạnh, hiện diện ở mọi nơi và rất bền vững (không bị mất hoạt tính khi bị xử lý ở 90 C trong 1 giờ). RNase A cắt liên kết phosphodiester nằm ngay sau một pyrimidine của một RNA sợi đơn.
5’ p Ap Gp Gp Cp Cp Gp Ap Ap Gp Up Gp Cp Ap Gp G 3’
5’ p Ap Gp Gp Cp + Cp + Gp Ap Ap Gp Up + Gp Cp + Ap Gp G 3’
- Ứng dụng chính
+ Loại bỏ RNA trong các chế phẩm DNA hay protein.
+ Loại bỏ các vùng không bắt cặp trên RNA trong thể lai RNA:DNA.
5. RNase H
Enzyme RNase H là một loại ribonuclease có khả năng cắt liên kết 3’- O-P của RNA trong sợi đôi của thể lai DNA:RNA để tạo ra các sản phẩm có đầu tận cùng 3’-OH và 5’-PO4. RNase H là một endonuclease không đặc
hiệu, xúc tác cắt RNA thông qua cơ chế thủy phân nhờ một ion kim loại hóa trị 2 liên kết với enzyme.
Trong tạo dòng phân tử, RNase H xúc tác cắt đặc hiệu RNA trong thể lại RNA:DNA mà không cắt DNA hoặc RNA không ở trong thể lai, enzyme này thường được dùng để phá hủy khuôn mẫu RNA sau khi tổng hợp sợi cDNA thứ nhất bằng phiên mã ngược, để tiếp tục tổng hợp sợi cDNA thứ hai tạo thành một sợi đôi cDNA.
- ; . Nhờ . - Ứng dụng chính + -loops. + protein hiệu . /đọc thêm
1. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, Hà Nội. Nội.
2. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. JA and Struhl K. 2002. Short Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed.
3. Brown TA. 2001. Gene Cloning-An Introduction. 4th ed. Blackwell
Science, Oxford, UK.
4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA. and Applications of Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA.
5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA. Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory Press, USA.
6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA. Englewood Cliffs, New Jersey, USA.
7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed. Blackwell Science, Oxford, UK. Manipulation. 6th ed. Blackwell Science, Oxford, UK.
Chương 3
Kh in vitro
chuỗi polymerase (PCR)
PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bư
(xem chương 1) và kỹ thuật Southern blot (xem chương 5).
kéo dài
in vitro hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần
hoàn (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Hình 3.1)
-
đ dạng
hiệu 20 nucleotide.
Hình 3.1. Thiết bị điều nhiệt tuần hoàn