Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các sản phẩm mỹ phẩm thường có nền mẫu rất phức tạp, khó vô cơ hóa.
Thêm vào đó, dư lượng kim loại nặng nhỏ, dễ bị mất hay nhiễm từ môi trường, dụng cụ trong quá trình vô cơ hóa. Do đó, chúng tôi lựa chọn phương pháp vô cơ hóa mẫu trong lò vi sóng do có ưu điểm: nhanh chóng, đưa kim loại lên mức oxy hóa cao nhất, vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, vô cơ hóa trong môi trường kín, các bước xử lý đơn giản nên tránh làm mất mẫu hay nhiễm mẫu từ môi trường. Với phương pháp vô cơ hóa trong lò vi sóng, chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố: tác nhân vô cơ hóa, tỷ lệ mẫu và tác nhân vô cơ hóa, chương trình áp suất, nhiệt độ trong lò vi sóng.
2.2.2. Phương pháp định lượng
2.2.2.1. Định lượng Nickel bằng phương pháp ETA-AAS
Trong mỹ phẩm, nickel và selen thường ở dạng vết, lượng mẫu vô cơ hóa nhỏ nên chúng tôi sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa trong lò graphit để tăng độ nhạy của phương pháp. Để đảm bảo độ chính xác, độ nhạy và độ ổn định của phương pháp, đề tài tiến hành khảo sát các thông số: vạch phổ hấp thụ, cường độ đèn, độ rộng khe đo, nồng độ acid và các thông số của chương trình nguyên tử hóa.
2.2.2.2. Định lượng Selen bằng phương pháp F-AAS kỹ thuật hydrid
Khảo sát sơ bộ định lượng Selen trong lò graphit cho thấy độ lặp kém nên nhóm nghiên cứu chọn kỹ thuật hydrid hóa. Đây là phương pháp có độ nhạy cao (cỡ 10-8), độ lặp tốt, ít bị ảnh hưởng bởi nền mẫu nên thích hợp định lượng selen trong mỹ phẩm. Sử dụng tác nhân khử là natri borohydrid và acid hydrocloric để đưa selen về dạng hydrid. Đề tài tiến hành khảo sát các thông số:
nồng độ các chất khử, tốc độ hút mẫu, tốc độ hút các dung dịch khử, tốc độ khí mang để chọn ra các điều kiện tối ưu cho phép đo.
27 2.2.3. Hóa chất, thuốc thử, thiết bị 2.2.3.1. Hóa chất, thuốc thử
Do yêu cầu của phương pháp AAS nên hóa chất và nước cất sử dụng phải có độ tinh khiết rất cao. Sử dụng hóa chất thuốc thử đạt tinh khiết phân tích (p.a) của hãng Merck bao gồm:
- Dung dịch acid nitric 65%
- Dung dịch acid sulfuric 98%
- Dung dịch hydro peroxyd 30 % - Dung dịch acid hydrocloric 37%
- Natri hydroxyd dạng pellet - Natri borohydrid dạng bột
- Nước trao đổi ion (suất điện trở ≥18MΩ.cm) Chất chuẩn:
- Dung dịch chuẩn gốc Selen 1000 àg/ml của hóng Merck - Dung dịch chuẩn gốc Nickel 1000 àg/ml của hóng Merck 2.2.3.2 Thiết bị, dụng cụ
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Hitachi Z-5000: xây dựng phương pháp định lượng nickel
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Thermo iCE 3500: xây dựng phương pháp định lượng selen
- Cân phân tích METAtler toledo
- Lò vi sóng START D của Milestone và cốc teflon - Máy lọc nước trao đổi ion easypure UV/UF
- Các dụng cụ thủy tinh, nồi cách thủy
Tất cả các máy móc, trang thiết bị và dụng cụ đã được hiệu chuẩn và kiểm định theo đúng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025, GLP. Các dụng cụ sử dụng trong phép đo đều được ngâm vào dung dịch acid nitric 10% trong 24h, tráng sạch 3
28
lần bằng nước trao đổi ion. Với dụng cụ đem cân đều phải sấy khô ở nhiệt độ 50oC trước khi dùng.
2.2.4. Đánh giá phương pháp
Các chỉ tiêu cần đánh giá: độ đặc hiệu, độ tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng, độ lặp lại.
2.2.4.1. Độ đặc hiệu
- Với quy trình định lượng nickel bằng ETA-AAS: độ đặc hiệu được xác định dựa vào phương pháp chồng phổ. Sử dụng phổ hấp thụ của dung dịch (dd) trắng, dd thử, dd chuẩn và dd thử thêm chuẩn. Yêu cầu: không có sự xuất hiện của pic ở mẫu trắng; mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn phải có cùng cực đại hấp thụ tại vạch phổ đã chọn của nickel.
2.2.4.2. Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ
Chuẩn bị 2 dãy dung dịch chuẩn nickel và selen có nồng độ tăng dần, xác định độ hấp thụ của các dung dịch này. Lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ và nồng độ dãy chuẩn và tính hệ số tương quan r.
Yêu cầu: r2 ≥ 0,99.
2.2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Pha 2 dãy dung dịch chuẩn nickel và selen, xác định phương trình hồi quy tuyến tính và tính các giá trị LOD và LOQ của mỗi phương pháp
Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác một cách có ý nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Giới hạn phát hiện (LOQ): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác một cách có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền
Trong đó SD: độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc mẫu thêm chuẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD; b: hệ số góc của phương trình hồi quy tuyến tính.
29 2.2.4.4. Độ lặp lại
Xác định bằng phương pháp thêm chuẩn tức là thêm chính xác một lượng chuẩn đã biết trước nồng độ vào một mẫu thử không chứa chất cần nghiên cứu.
Tiến hành xử lý mẫu và định lượng các mẫu đã chuẩn bị theo quy trình phân tích đã chọn, tính kết quả dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính, xác định tỷ lệ thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các giá trị này theo công thức:
Tỷ lệ thu hồi (%) = ượ ấ â í ì ạ
ượ ấ ẩ ê à x 100%
Yêu cầu: RSD ≤ 15%.
2.2.4.5. Độ đúng
Với mỗi loại nền mẫu (kem, phấn, son), chuẩn bị mẫu thử và 3 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất cần phân tích. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức 80%, 100% và 120% nồng độ cần phân tích. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện lặp lại 2 lần. Phân tích các mẫu này theo quy trình đã xây dựng được. Xác định tỷ lệ thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính
Yêu cầu: - Tỷ lệ thu hồi phải nằm trong khoảng 80% - 120%
- RSD ≤ 15%
Trên thực tế, tùy theo mục đích và phương pháp thử mà người phân tích có thể đưa ra các giới hạn chấp nhận phù hợp. Chúng tôi dựa trên giới hạn chấp nhận về độ chính xác và độ đúng của phương pháp theo AOAC và tài liệu hướng dẫn về thẩm định phương pháp AAS của WHO trong chương trình tập huấn nâng cao năng lực kiểm nghiệm của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương [27].
30
Bảng 2.2. Giới hạn chấp nhận về độ đúng của phương pháp theo AOAC [27]
Thành phần phân tích Tỷ lệ phân tích Đơn vị Giá trị chấp nhận (%)
100 1 100% 98-102
≥10 10-1 10% 98-102
≥1 10-2 1% 97-103
≥0,1 10-3 0,1% 95-105
0,01 10-4 100 ppm 90-107
0,001 10-5 10 ppm 80-110
0,0001 10-6 1ppm 80-110
0,00001 10-7 100 ppb 80-110
0,000001 10-8 10 ppb 60-115
0,0000001 10-9 1 ppb 40-120
Bảng 2.3. Giới hạn chấp nhận về độ chính xác của phương pháp theo AOAC [27]
Thành phần phân tích Tỷ lệ phân tích Đơn vị RSD (%)
100 1 100% 1,3
≥10 10-1 10% 2,7
≥1 10-2 1% 2,8
≥0,1 10-3 0,1% 3,7
0,01 10-4 100 ppm 5,3
0,001 10-5 10 ppm 7,3
0,0001 10-6 1ppm 11
0,00001 10-7 100 ppb 15
0,000001 10-8 10 ppb 21
0,0000001 10-9 1 ppb 30