3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.3.Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn
- Phương pháp nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn:
Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Viện Thú y quốc gia Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn đƣờng ruột (Bộ môn vi trùng thuộc Viện thú y quốc gia)
Bệnh phẩm
(Phân, máu tim, gan, lách, hạch ruột, dịch ruột)
Môi trường không chọn lọc BPW (370C/ 18- 24 h)
TSI
(370C/ 18- 24 h)
Xác định serotyp
Giữ giống Sal Môi trường tăng sinh
RV (420C/ 18- 24 h)
DHL (370C/ 20- 24 h)
Phản ứng lên men đường
Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh Xác định các yếu tố độc lực Môi trường thạch máu
(370C/ 18- 24 h) Thạch Mac Conkey (370C/ 18- 24 h) Thử phản ứng Oxidase (370C/ 18- 24 h) Enterobacteriaceae (370C/ 18- 24 h) Lactose + Lactose -
Giữ giống E.coli Giữ giống Sal
Lên men đường Lên men đường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Kiểm tra hình thái học:
Bệnh phẩm được nuôi cấy trên các môi trường thạch máu, thạch MacConKey, thạch DHL, bồi dưỡng trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Trên các đĩa thạch sau 18-24 giờ nuôi cấy ở 37oC, có thể quan sát thấy các dạng khuẩn lạc như sau:
Bảng 2.1. Màu sắc, hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn E.coli và Salmonella
khi nuôi cấy trên một số môi trƣờng
TT Loài vi khuẩn
Màu sắc và hình thái khuẩn lạc trên các loại môi trƣờng sau khi nuôi cấy ở 37OC/ 24 giờ
Thạch máu Thạch
MacConkey Thạch DHL
1 E.coli
Trắng đục, gọn, có
thể dung huyết Đỏ, không nhầy Hồng cánh sen
2 Salmonella sp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trắng đục, gọn,
không dung huyết Trắng đục Đen, tròn, gọn
Căn cứ vào màu sắc hình dạng khuẩn lạc mọc trên các môi trường mà có thể xác định và phân loại vi khuẩn đường ruột. Những khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn E.coli hoặc Salmonella được đưa lên kính hiển vi để kiểm tra hình thái và tiến hành giám định bằng các đặc tính sinh hóa học của vi khuẩn. Nếu được xác định là thuần khiết thì dùng trong việc xác định serotype và giữ giống để tiến hành các thí nghiệm khác.
2.4.3.1. Phương pháp giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E.coli và Salmonella sp.
- Phản ứng sinh Indol - Phản ứng Oxidaza
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Phản úng Catalaza - Phản ứng H2S - Khả năng di động
- Phản ứng lên men đường.
2.4.3.2. Phương pháp xác định serotype của các chủng vi khuẩn phân lập được
2.4.3.2.1. Vi khuẩn E.coli:
Được thực hiện bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Vi khuẩn E.coli có nhiều serotype O khác nhau, do vậy bước quan trọng đầu tiên là xác định được nhóm serotype O, sau đó tiến hành các phản ứng ngưng kết với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm cần xác định. Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác định serotype gồm:
- Các chủng E.coli cần định type được giữ trên thạch máu - Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá)
* Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau:
Nhỏ lên hai đầu lam kính sạch, mỗi đầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E.coli cần xác định trên môi trường thạch máu trộn đều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (đối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết sẽ xuất hiện sau một phút.
- Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong.
- Phản ứng âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều giống như bên đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Với những chủng có ngưng kết với các kháng huyết thanh nhóm, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để xác định rõ từng serotype. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
2.4.3.2.2. Vi khuẩn Salmonella sp:
Được tiến hành định type theo phương pháp Kauffmann (1972)
* Xác định nhóm kháng nguyên O bằng huyết thanh đa giá: sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh với kháng nguyên sống trên phiến kính (Slide agglutination) để xác định nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. Phương pháp được tiến hành như sau:
Phiến kính sạch được chia làm 2 phần. Dùng ống hút Pasteur hoặc que cấy vô trùng, nhỏ mỗi bên phiến kính 1 giọt nước muối sinh lý. Dùng que cấy vô trùng, lấy một ít khuẩn lạc điển hình của chủng vi khuẩn Salmonella cần định type đã mọc trên môi trường thạch máu, trộn đều với nước sinh lý đã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên. Sau đó tiến hành nhỏ 1 giọt thuyết thanh đa giá nhóm O vào huyễn dịch kháng nguyên đã chuẩn bị ở bên thí nghiệm, còn bên đối chứng thì nhỏ 1 giọt nước sinh lý (đối chứng âm) và trộn đều. Sau 1-2 phút đọc kết quả.
- Phản ứng dương tính khi có cụm ngưng kết xuất hiện, nước xung quanh trong. - Đối chúng âm: hỗn dịch vẫn đục đều.
- Nếu hỗn dịch cả 2 đầu phiến kính đều xuất hiện hiện tượng ngưng kết là ngưng kết giả do vi khuẩn tự ngưng kết, lúc đó phải tiến hành làm lại.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Xác định kháng nguyên H với kháng huyết thanh H đa giá:
Cho vào ống nghiệm có chứa 2,5ml canh trùng một lượng tương đương dung dịch Salin và formol. Để ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ, sau đó lấy 1 ống nghiệm vô trùng mới, cho vào đó 0,25ml hỗn dịch nói trên, cho thêm vào đó 0,25ml kháng huyết thanh đã pha sẵn hoặc 1 giọt kháng huyết thanh H đa giá, đun cách thủy 500
C trong 1 giờ, rồi đọc kết quả:
- Phản ứng dương tính khi kháng nguyên và kháng huyết thanh kết hợp với nhau, tạo nên kết tủa bông rõ ở đáy ống nghiệm.
- Phản ứng âm tính khi không thấy kết tủa ở đáy ống nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Xác định kháng huyết thanh H đơn giá: tương tự như cách xác định kháng nguyên O đơn giá, nhưng phải tiến hành làm phản ứng với 2 pha: phase 1 (đặc hiệu) và phase 2 (không đặc hiệu).
2.4.3.3. Phương pháp xác định một số yếu tố gây bệnh của chủng vi khuẩn E.coli và Salmonella phân lập được
2.4.3.3.1. Dùng phản ứng PCR để xác định một số yếu tố gây bệnh (Yếu tố bám dính và độc tố) của chủng vi khuẩn E.coli phân lập được.
* Cách tiến hành:
- DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli mọc trên môi trường thạch máu ở 370
C/24h;
- Hỗn hợp phản ứng PCR gồm:
Primers: 1µl mỗi loại
Dung dịch đệm (5X): 1µl
Enzyme (Taq polymerase): 1µl
Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25µl cho một phản ứng. - Chu trình của phản ứng PCR: phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Loại yếu tố gây bệnh cần xác định
Chu trình
thứ nhất 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) F4; F5 95/5 94/1 55/1 72/1 72/7 STa; STb; LT; VT2e 95/5 94/1 50/1 72/1 72/7
- Chạy điện di: Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye) với mẫu theo tỷ lệ 1:5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris – Agartate – EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm phốt phát nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại phân tử có kích thước lớn chạy chậm, loại có kích thước bé chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (BEt 1µl/ml) trong vòng 15 phút. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do.
- Đọc kết quả: bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn acid nicleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. kích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thước các băng DNA được so sánh với DNA chuẩn (DNA marker), được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn sản phẩm PCR.
2.4.3.3.2. Dùng phản ứng PCR để xác định một số yếu tố gây bệnh (độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104) của các chủng Salmonella phân lập được.
* Tách DNA:
Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 37o
C trong 24 giờ. Lấy 1 – 2 khuẩn lạc hòa vào 300 µl nước khử ion vô trùng. Đun cách thủy ở 100o
C trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa DNA để làm phản ứng PCR.
* Primer (mồi):
Trình tự các các cặp mồi và kích thước các sản phẩm PCR dùng để xác định độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104 (definitive phage type 104) của Salmonella dựa trên các nghiên cứu đã được công bố của các tác giả: Suzuki và cs (1994) [114]; Pritchett và cs (2000) [105]; Saitoh và cs (2005) [109]; Cloeckaert và cs (2006) [76]; Cortez và cs (2006) [77]; Skyberg và cs (2006) [111].
* Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần:
- 5µl PCR buffer 5x [( 750mM Tris-HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0,1% Tween 20) (ABgene), 2mM MgCl2,200µM của mỗi loại dNTP].
- 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM /µl).
- 0,05 µl Taq DNA Polymerase ( 5 units/µl) (Abgene). - Nước cất vừa đủ 25 µl cho một phản ứng.
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai đoạn: Tiền biến ở 94oC/ 5 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94oC/1 phút, ủ bắt cặp mồi 50o
C/1 phút, kéo dài 72oC/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 72o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Chạy điện di:
Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm sản phẩm PCR được chạy điện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
*Nhuộm:
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 µl/ml) trong vòng 15 phút.
* Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới đèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc. Kích thước các băng DNA được so với DNA chuẩn (DNA marker).
2.4.3.4. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn E.coli và Salmonella
- Để xác định độc lực của các chủng vi khuẩn gây bệnh, có thể thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm
* Phương pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm Các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Các vi khuẩn thuần từ môi trường giữ giống được cấy vào môi trường BHI sau đó canh trùng được bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ, trong quá trình nuôi có lắc để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn.
Bước 2: Đếm số lượng trong 1 ml canh khuẩn sau nuôi cấy 24 giờ.
Bước 3: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, khối lượng từ 18 - 20g, với liều 0,2 ml/chuột, tiêm xoang phúc mạc. Trong thí nghiệm, mỗi lô chuột để 2 con không tiêm dung dịch BHI làm đối chứng.
Bước 4: Theo dõi những biểu hiện, triệu chứng phản ứng sau tiêm. Kiểm tra và đánh giá số chuột tới 7 ngày.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn.
Bước 5: Những chuột chết được đánh giá qua lâm sàng, mổ khám kiểm tra sự biến đổi của các cơ quan nội tạng, sau đó tiến hành nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm của chuột chết.
Chuột chết mổ khám, các cơ quan nội tạng có những bệnh tích điển hình như mắc bệnh tự nhiên, khi nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn cho kết quả dương tính là cơ sở để kết luận về độc lực của vi khuẩn.
2.4.3.5. Phương pháp xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn phân lập được đối với một số kháng sinh
Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng phương pháp kháng sinh đồ của Kirby- Bauer và đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giá kết quả của NCCLS (2000) (Các tiêu chuẩn lâm sàng trong phòng thí nghiệm của Hội đồng quốc gia Mỹ - National committee for Clinical Laboratory Standards) [98].
* Các bước tiến hành đối với vi khuẩn E.coli và Salmonella:
Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muellier Hinton
Bước 2: Các chủng E.coli và Salmonella nuôi cấy trong môi trường BHI được dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muellier Hinton
Bước 3: Giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid được đặt khoảng cách đều nhau trong đĩa
Bước 4: Bồi dưỡng ở 370C trong 18 - 24 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.2. Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
TT Loại kháng sinh Hàm lƣợng Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng 1 Amikacin 30 µg ≥ 17 15 – 16 ≤ 14 2 Amoxicillin 20 µg ≥ 20 - ≤ 19 3 Ampicillin 10 µg ≥ 22 12 – 22 ≤ 11 4 Enrofloxacin 5 µg ≥ 15 12 – 14 ≤ 11 5 Streptomycin 10 µg ≥ 16 12 – 15 ≤ 11 6 Gentamycin 10 µg ≥ 18 13 - 17 ≤ 12 7 Norfloxacin 10 µg ≥ 18 13 – 17 ≤ 12 8 Neomycin 30 µg ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 9 Spectinomycin 10 µg ≥ 16 13 – 15 ≤ 12 10 Tetracycline 30 µg ≥ 23 19 – 22 ≤ 18 2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê toán học và sinh vật học Nguyễn Văn Thiện và cs (2002) [58], kết hợp sử dụng phần mềm Excell.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3. TÌNH HÌNH THỜI TIẾT, KHÍ HẬU TRÊN ĐỊA PHẬN LÂM ĐỒNG
Trên địa bàn Lâm Đồng có ba khu vực theo dõi thời tiết khí hậu, đó là Trạm Bảo Lộc; Trạm Liên Khương; Trạm Đà Lạt. Tại đây chúng tôi chỉ trình bày điều kiện khí hậu có ảnh hưởng đến các vùng chăn nuôi.
Bảng 3a. Tình hình thời tiết khí hậu tại trạm Bảo Lộc