1.1. Cơ sở khoa học
1.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng khi đông lạnh hoạc giải đông
Khi đông lạnh hoặc giải đông các hiện tượng đông băng sẽ ảnh hưởng sự sống của tình trùng. Các nhân tố giúp tinh trùng tồn tại khi đông lạnh hoặc giải đông:
- Sức đề kháng của tinh trùng đối với đông lạnh: sức kháng đông của tinh trùng là khả năng chịu được đông lạnh của tinh trùng và thường được đo bằng tỷ lệ hồi phục lại của tinh trùng sau khi đông lạnh và giải đông. Ở bò đực, sức kháng đông của tinh trùng là khác nhau, tùy theo từng cá thể bò đực, điều kiện lúc lấy tinh và tuổi của bò đực.
+ Giống, cá thể và tuổi: sức kháng đông của tinh trùng thể hiện rõ giữa các cá thể bò đực, nhưng không rõ ràng giữa các giống khác nhau. Bò đực có tuổi 1- 1,5 năm tuổi, tinh trùng có sức kháng đông thấp, từ 2 năm tuổi trở lên có sức kháng đông cao. Nhưng từ 6 năm tuổi trở lên tinh trùng của chúng có sức kháng đông giảm xuống (Phạm Văn Tiền, 2014) [26].
+ Mùa vụ: mùa hè nhiệt độ không khí cao nên sức kháng đông của tinh trùng vào mùa này thường thấp.
+ Số lần lấy tinh liên tiếp: khi khai thác tinh liên tiếp thì tinh trùng thu được từ lượt phóng tinh thứ hai cho thấy sức kháng đông tốt hơn so với tinh trùng thu được từ lượt phóng tinh đầu.
- Thành phần của môi trường pha loãng: môi trường pha loãng tinh dịch có thành phần cơ bản là đường saccharid, chất đệm và lòng đỏ trứng gà. Nồng độ tối ưu của lòng đỏ trứng là 15-20 %, nếu nồng độ này quá thấp hoặc quá cao thì không tốt cho tinh trùng. Chức năng này chủ yếu do tác động của lipoprotein và lecithin trong lòng đỏ. Đường saccharide đóng vai trò quan trọng trong môi
trường, do tác động đến áp suất thẩm thấu, nó có tác dụng bảo vệ tinh trùng khi ở nhiệt độ thấp và là nguồn năng lượng cho tinh trùng.
Chất đệm có vai trò quan trọng trong duy trì màng sinh chất của tinh trùng khi đông lạnh và khi giải đông, trong kích thích trao đổi chất diễn ra bình thường ở tinh trùng sau giải đông đồng thời duy trì sức sống của chúng. Chất đệm phải phù hợp như là môi trường khi đông lạnh và phải có đặc tính sau:
+ Duy trì mức thấp nhất về sự tổn hại cho tinh trùng do các muối gây ra.
+ Phải tan trong nước với hằng số phân ly điện tích là 6-8.
+ Khả năng thấm qua màng sinh chất phải thấp và có sức đề kháng mạnh với các enzyme.
- Bảo quản tinh đã pha loãng ở 50C trước khi đông lạnh: bảo quản tinh đã pha loãng ở 50C trước khi đông lạnh sẽ tăng cường sức kháng đông cho tinh trùng bò đực. Tinh bò đực sau khi khai thác và đủ tiêu chuẩn pha chế thì tiến hành xử lý gồm:
+ Pha loãng lần đầu tinh dịch ở 350C
+ Làm lạnh dần xuống 50C và bảo quản trong thời gian 1,5 – 2 giờ.
+ Pha loãng lần hai với môi trường có chứa glycerol + Cân bằng trong 4 giờ
+ Đông lạnh tinh trùng
+ Bảo quản tinh trùng đã làm lạnh ở 50C trước khi pha loãng lần hai
- Nồng độ của glycerol: nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng cuối cùng để làm đông lạnh tinh trùng bò vào khoảng 7 %, nhưng tỷ lệ này có hơi khác nhau tùy theo các thành phần của môi trường pha loãng. Nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng có mối tương quan đáng tin cậy với tốc độ giải đông, đó là nồng độ glycerol cao trong môi trường pha loãng là cần thiết cho tốc độ giải đông nhanh (Hiroshi, 1992) [44].
- Tốc độ làm lạnh: tốc độ làm lạnh quá cao sẽ gây tổn hại tới tinh trùng vì nó gây ra siêu lạnh, thể vẩn và nước lưu giữ trong tế bào. Điều đó gây ra đông lạnh ngoại bào và sau đó đông lạnh nội bào. Tốc độ làm lạnh chậm sẽ gây ra tập
trung nồng độ cho cả dung dịch ngoại bào và dung dịch nội bào và sẽ làm rối loạn tế bào, đây được coi là ảnh hưởng của dung dịch.
- Tốc độ giải đông: tốc độ giải đông có ảnh hưởng lớn đến sức sống, hoạt lực, tỷ lệ acrosome bình thường và quá trình trao đổi chất bình thường của tinh trùng. Giải đông tinh cọng rạ bằng nước 350C sức sống tinh trùng cao hơn so với nước 40C hoặc 200C. Giải đông ở nước 35-750C, cũng cho tỷ lệ acrosome bình thường cao hơn so với nước 40C hoặc 200C. Nếu tinh được bảo quản ở nhiệt độ 370C sau khi giải đông, tinh đông viên nào được giải đông nhanh ở nhiệt độ cao hơn thì sẽ duy trì được sức sống tinh trùng cao hơn (Trịnh Văn Bình, 2013) [4].
- Thời gian bảo quản: tinh trùng đông lạnh phải luôn luôn được bảo quản ngập chìm trong nitơ lỏng (-1960C), nếu bảo quản tốt sau vài chục năm, tỷ lệ sống và hoạt lực tinh trùng của tinh trùng vẫn không thay đổi, khả năng thụ tinh vẫn không bị giảm (Hà Văn Chiêu, 1997) [8].
1.1.6. Nguyên tắc môi trường pha loãng tinh dịch bò
Môi trường pha loãng tinh dịch là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tồn tại của tinh trùng trong quá trình đông lạnh. Theo Ivanop (1890) được (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [15] trích dẫn, môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch là một môi trường lý, hóa học, đáp ứng đầy đủ các điều kiện sống và trao đổi chất của tinh trùng và sau khi bảo tồn có khả năng hồi phục chức năng hoạt động và thụ tinh. Vì vậy, môi trường phải đảm bảo các nguyên tắc cơ bản sau:
- Áp lực thẩm thấu
Áp lực thẩm thấu của môi trường phải tương đương áp lực thẩm thấu của tinh dịch. Áp lực thẩm thấu là áp suất cần thiết trong dung dịch tác động lên màng tế bào làm ngừng hiện tượng thẩm thấu. Đây là nguyên tắc cơ bản cao nhất, chỉ trong điều kiện cân bằng về áp lực thẩm thấu tinh trùng mới giữ nguyên được hình thái và quá trình trao đổi chất. Môi trường ưu trương hay nhược trương đều có thể giết chết tinh trùng, bởi vậy trong các môi trường này tinh trùng sẽ bị teo đi hay trương phồng lên dẫn tới cấu trúc bị thay đổi tinh trùng bị chết một cách nhanh chóng. (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [15].
- Độ pH:
Môi trường phải có độ pH tương đương độ pH của tinh dịch hoặc hơn toan một chút. Nồng độ H+ càng tăng thì môi trường càng toan tính và ngược lại. Môi trường pha loãng tinh dịch phải có pH 6,2 - 6,8 (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997) [1].
- Năng lực đệm của môi trường:
Bảo tồn tinh dịch là giữ cho tinh trùng sống. Sự sống luôn được gắn liền với quá trình trao đổi chất mà bản chất quá trình trao đổi chất của tinh trùng trong thời gian bảo tồn là quá trình đường phân yếm khí. Quá trình này luôn thải ra môi trường axit lactic, làm cho nồng độ H+ trong môi trường luôn có xu hướng tăng lên. Sự tăng lên của H+ có nguy cơ gây đầu độc tinh trùng. Do đó phải bổ sung thêm chất đệm vào môi trường, thường là đệm một chiều, như muối kim loại kiềm của các axit hữu cơ yếu như: Natri xitrat, Kali tartrat, Natri bicarbonat… (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [15].
- Tỷ lệ giữa chất điện giải và chất không điện giải:
Môi trường phải đảm bảo có tỷ lệ giữa chất điện giải và không điện giải thích hợp.
Chất không điện giải thường là các đường (glucose, fructose...). Ngoài việc cung cấp năng lượng cho tinh trùng trong quá trình trao đổi chất, đường có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ tinh trùng tránh cho tinh trinh trùng không bị mất điện tích bề mặt một nguyên nhân gây ra hiện tượng kết dính tinh trùng thành từng đám. (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [15].
Tinh trùng rất mẫn cảm với dung dịch muối, như NaCl, BaCl2… , nhưng trong quá trình pha chế, người ta vẫn phải đưa vào môi trường một lượng nhất định muối không độc và có chứa các anion có hóa trị cao.
- Môi trường phải có đặc điểm vật lý phù hợp với tinh trùng: Tỷ trọng của môi trường phải tương đương tỷ trọng của tinh dịch. Nguyên tắc này đảm bảo cho môi trường và tinh dịch hòa tan vào nhau, tinh trùng tránh được lực đẩy Acsimet.