2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Khảo nghiệm quy trình sản xuất tinh đông lạnh
2.3.2.1. Quy trình khai thác và sản xuất tinh bò đông lạnh dạng viên Các bước của quy trình khai thác tinh:
Thời gian khai thác tinh từ 7 giời đến 8 giờ.
Tần suất khai thác tinh dịch: 2 lần/tuần.
- Chuẩn bị âm đạo giả: Các bộ phận của âm đạo giả được khử trùng rồi lắp ráp vào bảo quản trong tủ ấm 420C trước khi lấy tinh.
- Chuẩn bị bò đực lấy tinh: Những bò đực giống đến ngày lấy tinh vào buổi sáng sớm được vệ sinh sạch sẽ và thụt rửa bao dương vật trước khi lấy tinh 30 phút bằng nước muối sinh lý 0,9%.
- Lấy tinh: Kích thích cho bò đực hưng phấn, rồi cho nhảy giá và lấy tinh bằng âm đạo giả. (Mẫu tinh dịch khi khai thác được đưa ngay vào phòng thí nghiệm và đặt trong bể nước ấm 350C để kiểm tra các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch)
- Chuẩn bị môi trường pha loãng tinh dịch, môi trường có nhiệt độ 350C để cân bằng nhiệt độ với nhiệt độ tinh dịch.
- Pha loãng tinh dịch: nếu tinh dịch đạt tiêu chuẩn theo quy định tiêu chuẩn của Bộ Nông nghiệp và PTNT (2015) [6], thì pha vào môi trường. Cân bằng nhiệt ở nhiệt độ 50C trong khoảng 4 giờ.
- Đông lạnh tinh: Đông lạnh tinh ở nhiệt độ hơi nitơ -950C và đông lạnh sâu trong môi trường nitơ lỏng -1960C.
- Kiểm tra hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh: Sau khi đông lạnh 48 giờ, tinh trùng được lấy mẫu điểm theo từng con đực giống, giải đông và kiểm tra.
- Bảo quản: Tinh đông lạnh dạng viên đạt tiêu chuẩn thì được đóng vào ống đựng tinh (có ghi rõ ngày sản xuất và tên số hiệu của từng đực giống), bảo quản trong bình chuyên dụng chứa đầy nitơ lỏng (-1960C).
2.3.2.2. Thực hiện quy trình đông lạnh tinh dịch bò a. Môi trường pha loãng tinh dịch
Tiến hành pha chế môi trường, thành phần môi trường pha loãng tinh dịch bò (theo tiêu chuẩn Việt Nam) do Viện chăn nuôi quốc gia cung cấp.
Bảng 2.1: Thành phần pha môi trường loãng tinh dịch (*)
STT Thành phần môi trường ĐVT Số lượng
1 Nước cất 2 lần ml 100
2 Dung dịch lactose 11% % 73
3 Glycerin C3H5(OH)3 % 7
4 Lòng đỏ trứng gà % 20
5 Gentamici mg 80
(*: Công thức do Viện chăn nuôi chuyển giao cho Trung tâm theo dự án).
b. Cách pha chế môi trường pha loãng tinh dịch
Chuẩn bị 1 lọ đựng sạch, vô khuẩn: ghi nhãn hiệu bên ngoài môi trường (ngày/tháng/ năm).
+ Xác định làm 100ml môi trường.
+ Tiến hành lấy lòng đỏ trứng gà vào một lọ riêng, khuấy thật nhẹ đều trong 5 -7 phút.
+ Lấy 11g lactose hoà với 100 ml nước cất 2 lần ở nhiệt độ 380C - 420C đến khi tan hết thì hạ nhiệt độ xuống 200C rồi lọc sạch hút lấy 73ml, rồi cho vào đó 7ml glycerine và 1 lọ gentamycine 80mg sau đó khuấy thật đều.
+ Đổ trứng gà cùng hỗn hợp trên vào lọ đã sạch và vô khuẩn sau đó khuấy thật nhẹ nhàng bằng đũa thuỷ tinh.
+ Để môi trường trong khoảng 45 - 60 phút sao cho đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu, pH.
Chuẩn bị dụng cụ hoá chất: Nước cất 2 lần, trứng gà mới sạch và vô khuẩn, glyxerin và một số dụng cụ khác cần để pha chế như: lọ, bình đựng, ống hút, pipét…Tiến hành pha môi trường trước khi khai thác tinh khoảng 30 - 40 phút đảm bảo cân bằng về áp suất thẩm thấu, pH, tỷ trọng.
c. Chuẩn bị tinh dịch bò
- Tinh dịch bò sau khi khai thác được kiểm tra phẩm chất tinh dịch thật nhanh các chỉ tiêu: A, C, V, K, pH, màu sắc chính xác đảm bảo yêu cầu kỹ thuật được đưa vào pha loãng.
d. Pha loãng tinh dịch bò
Tỷ lệ pha loãng biến động tuỳ theo chất lượng tinh nguyên của bò đực.
Khi pha tinh dịch cần tính toán để khi đưa vào đông lạnh mỗi viên tinh sản xuất có chứa từ 40 - 50 triệu tinh trùng (xấp xỉ 12 - 18 triệu tinh trùng tiến thẳng).
Sau khi tinh dịch và môi trường đã được hoà trộn vào với nhau cần kiểm tra lại các chỉ tiêu như: V, A, C, pH.
Sau khi kiểm tra xong các chỉ tiêu để ống nghiệm vừa pha loãng vào cốc có nhiệt độ 370C sao cho nước trong cốc ngập lượng tinh trong ống nghiệm, sau đó lấy parafin bịt miệng của ống nghiệm lại.
e. Cân bằng tinh dịch
Đánh dấu vào lọ đựng tinh đem cân bằng bảo quản trong tủ lạnh 50C (4h) g. Kiểm tra chất lượng tinh dịch sau cân bằng
Trước khi đông lạnh (sau cân bằng) tinh dịch được mang kiểm tra xác định hoạt lực của tinh trùng (A%) qua kính hiển vi với độ phóng đại 200 lần. Quan sát toàn vi trường và đánh giá hoạt lực của tinh trùng; kiểm tra thật nhanh và đưa vào sản xuất tinh đông viên.
h. Thao tác làm tinh đông viên ở bò
- Chuẩn bị: Một hộp xốp có kích thước 36 x 36 x 15(cm) trong đó có 2 thanh làm giá đỡ cho tấm mêca, cách mặt trên của hộp xốp khoảng 7cm, tấm mêca mỏng mặt trên nhẵn, đổ dung dịch Nitơ lỏng vào hộp xốp sao cho dung dịch ngập tấm mêca đặt trên giá đỡ.
- Nhúng tấm mêca mỏng (0,6mm) ngập trong hộp đựng dung dịch nitơ lỏng (- 1960C) trong vòng 5 - 10 phút khi nào tấm mêca hết sủi bọt là đạt.
- Nhấc tấm mêca lên giá đỡ trong hộp, sao cho 1/3 tấm mêca có mặt dưới giáp mặt dung dịch nitơ lỏng đồng thời phải để bề mặt trên tấm mêca phủ một
lớp tuyết màu trắng là được, sau đó dùng Pipet nhỏ hút nhẹ nhàng tinh dịch pha loãng (đã cân bằng), nhỏ lên bề mặt tấm mêca từng giọt nhỏ, hình cầu, thể tích một viên tinh đạt 0,1 - 0,2ml đảm bảo cho một viên tinh cách nhau 1 - 2cm là được. Để 1 – 2 phút, viên tinh có màu trắng hơi vàng, đảm bảo đông lạnh nông (-860C - 1000C âm ) trong nitơ lỏng. Sau đó tiến hành đếm và ghi kết quả.
- Nhúng tấm mêca đã có viên tinh ngập vào dung dịch nitơ lỏng trong 5 phút. Sau đó nhấc tấm mêca lên gạt hết viên tinh trên mặt vào trong ống đựng tinh (để ngập trong dung dịch nitơ lỏng).
i. Kiểm tra chất lượng tinh sau giải đông 24h
Kiểm tra chỉ tiêu A% sau giải đông: Lấy ngẫu nhiên 1-2 viên tinh giải đông ở nước ấm nhiệt độ 2 mức (250C – 300C) và (350C - 370C), thời gian 30 giây theo từng ngày sản xuất của từng bò đực để đánh giá hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh của lô sản xuất đó bằng kính hiển vi với (A ≥ 35%) đạt tiêu chuẩn.