Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Chương 2. Ố ƯỢN , ỊA ỂM, THỜ AN VÀ P ƯƠN P ÁP NGHIÊN CỨU

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.3. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Đo đếm các chỉ tiêu phân loại dựa vào tài liệu hướng dẫn nghiên cứu cá của Pravdin (1973) [19].

Mẫu cá khi đƣợc thu ngoài thực địa và mẫu cá nuôi về sẽ đƣợc xử lý, đánh số để chụp ảnh và đƣợc cố định bằng formon 4% hoặc cồn 700, sau đó tiến hành phân tích các chỉ tiêu hình thái cấu tạo bên ngoài theo trình tự sau:

− Quan sát màu sắc, hình dạng và miêu tả đặc điểm các cơ quan bên ngoài.

− Xác định khối lƣợng cá.

− Đo các chỉ tiêu:

+ Lt: Chiều dài tổng (mm) + Ls: Chiều dài chuẩn (mm)

+ Lcđ: Chiều dài cuống đuôi (mm) + Hb: Chiều cao thân (mm)

+ Lh: Chiều dài đầu (mm) + Hh: Chiều cao đầu (mm) + Diae: đường kính mắt (mm)

+ Dis2e: Khoảng cách giữa hai mắt (mm) Ngoài các thông số trên, trong nghiên cứu còn xác định hình thái cá dựa vào các cấu tạo vây lƣng thứ nhất (D1), vây lƣng thứ hai (D2), vây ngực (P), vây bụng (V), vây đuôi (C), vây hậu môn (A), dạng miệng.

2.4.3.2. Nghiên cứu về sinh trưởng

Xác định tương quan giữa chiều dài và khối lượng: Tương quan giữa chiều dài và khối lượng cá Ong căng được biểu thị bằng phương trình sinh trưởng của Berverton – Holt (1956) [19]: W  a Lb

33 Trong đó:

W : Khối lƣợng toàn thân của cá (g) L : Chiều dài toàn thân của cá (cm)

a,b : Các hệ số tương quan được giải bằng phương pháp hồi quy tuyến tính theo nguyên tắc bình phương nhỏ nhất.

Bằng các số liệu thực tế trên loài cá nghiên cứu, dựa vào phương pháp hồi quy tuyến tính để tính các hệ số a, b. Các hệ số này được đưa vào phương trình trên để thể hiện sự tương quan của loài cá.

Xác định tuổi: Dùng vẩy để xác định tuổi cá Ong căng. Mẫu vẩy quan sát đƣợc ngâm trong dung dịch NaOH 4% để tẩy mỡ, các chất bẩn hay sắc tố bám trên vẩy.

Sau đó vớt ra, dùng bút lông mềm chải nhẹ làm sạch các chất bẩn hay sắc tố bám trên vẩy sao cho chỉ còn lại vẩy cá trong suốt. Rửa sạch bằng nước, lau khô, quan sát vòng năm và đo bán kính vẩy, kích thước vòng năm dưới kính hiển vi có gắn trắc vi thị kính.

Tốc độ tăng trưởng: Sử dụng phương pháp của Rosa Lee (1920) để xác định mức tăng chiều dài cả cá Ong căng với công thức:

 

t t

L V L a a

V   (1)

Trong đó: Lt : Chiều dài cá ở tuổi t cần tìm (mm)

L : Chiều dài hiện tại đã đo đƣợc của cá (mm)

Vt : Khoảng cách từ tâm vẩy đến vòng năm thứ t (mm) V : Bán kính vẩy (đo trên trắc vi thị kính)

a : Chiều dài cá bắt đầu có vẩy (mm) (được tính bằng phương trỉnh thực nghiệm)

Giá trị a được xác định dựa vào số liệu kích thước vẩy và chiều dài tương ứng được giải theo các phương pháp hồi quy tuyến tính[19].

Sau khi có trị số Lt chúng tôi tính tốc độ tăng trưởng chiều dài năm Tn, theo công thức:

Tt Lt L(t1) (2)

Trong đó: Tt : Tốc độ tăng trưởng chiều dài của cá ở lứa tuổi t (mm) Lt : Chiều dài cá ở lứa tuổi t (mm)

L(t – 1) : Chiều dài cá ở lứa tuổi (t – 1) (mm)

34

Thay các số liệu chiều dài hàng năm tính được từ phương trình (1) vào (2) ta sẽ xác định được tốc độ tăng trưởng chiều dài hàng năm của cá Ong căng.

Phương trình sinh trưởng Von Bertalanffy (1952):

- Về chiều dài: Lt  L1ek t t0 - Về khối lƣợng: 1  0

k t t b

Wt  W    e   

Trong đó: L∞ : Chiều dài tối đa của cá (mm) Lt : Chiều dài cá ở lứa tuổi t (mm) W∞ : Khối lƣợng tối đa của cá (g) Wt : Khối lƣợng cá ở lứa tuổi t (g)

t và to: Khoảng thời gian cá sinh trưởng từ thời điểm to đến t tuổi b: Hệ số tương quan giữa chiều dài và khối lượng của cá

k: Chỉ số đường cong (corvature parametes) hay hệ số phân hóa Protein trong cơ thể cá

Giá trị các tham số L∞ , W∞ , k , to của phương trình Von Bertalanffy (1952) được xác định trên cơ sở xử lý số liệu thu được qua các phương trình toán học thực nghiệm.

2.4.3.3. Nghiên cứu về dinh dưỡng

Nghiên cứu thức ăn tự nhiên của cá Ong căng sẽ làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình ƣơng nuôi, đóng góp thêm đối tƣợng nuôi mới, tạo thế đa canh trong nuôi sinh thái của các loài cá nước lợ.

Xác định thành phần thức ăn: Thức ăn đƣợc tách khỏi ruột và dạ dày theo nhóm kích thước cá. Quan sát dưới kính hiển vi hoặc kính lúp hai mắt. Vẽ các mẫu thức ăn quan sát được trong thị trường của kính để phân loại hình thái từng nhóm (taxon) phân loại của các nhóm.

Chúng tôi sử dụng khoá phân loại thực vật bậc thấp của Shirota (1968) [82] và Trương Ngọc An (1993) [1], Khóa phân loại động vật không xương sống thuỷ sinh của Đặng Ngọc Thanh, Phạm Văn Miên (1981) [23] và Nguyễn Xuân Quýnh (2001) [21] để định loại và phân loại các nhóm thức ăn. Đếm số lƣợng thức ăn để xác định tần số xuất hiện và các mức độ tiêu hoá thức ăn.

Phương pháp phân tích phổ dinh dưỡng: Phổ dinh dƣỡng của cá Ong căng

35

theo phương pháp khối lượng của Biswas (1993) [48]. Khối lượng của mỗi loại thức ăn đƣợc xác định bằng cân phân tích. Khối lƣợng của tất cả thức ăn trong ống tiêu hóa của từng mẫu cá đƣợc cộng lại để có đƣợc tổng khối lƣợng thức ăn trong ống tiêu hóa của mẫu cá đang xét. Khối lƣợng của mỗi loại thức ăn đƣợc tính bằng phần trăm trên tổng khối lƣợng thức ăn có trong ống tiêu hóa cá.

Xác định cường độ bắt mồi của cá: Dựa vào sức chứa thức ăn trong ống tiêu hóa để đánh giá cường độ bắt mồi. Sức chứa tính theo độ no của cá. Xác định độ no dạ dày và ruột theo thang 5 bậc (từ bậc 0 đến bậc 4) của Lebedev [19].

Bậc 0: Ruột và dạ dày không chứa thức ăn.

Bậc 1: Ruột có thức ăn, dạ dày không có thức ăn.

Bậc 2: Ruột và dạ dày có thức ăn nhƣng còn khoảng trống không chứa thức ăn.

Bậc 3: Ruột và dạ dày có chứa nhiều thức ăn, phình to và không còn khoảng trống.

Bậc 4: Ruột và dạ dày chứa đầy thức ăn, vách dạ dày phình to.

Xác định hệ số béo: Sử dụng các phương pháp của Fulton (1902) và Clark (1928) để xác định hệ số béo của cá Ong căng [19].

Q W3.100

 L ( Fulton)

Qo W30.100

 L ( Clark)

Trong đó: Q : Hệ số béo theo Fulton Q0 : Hệ số béo theo Clark

L: Chiều dài cá từ mút mõm đến hết tia vây đuôi dài nhất (mm) W : Khối lƣợng toàn thân cá (g)

W0 : Khối lƣợng cá bỏ nội quan (g)

Từ kết quả tính đƣợc, chúng tôi so sánh để đánh giá độ béo của cá.

2.4.3.4. Nghiên cứu về sinh sản

Nghiên cứu sinh sản cá theo các phương pháp nghiên cứu ngư loại phổ biến đƣợc sử dụng trong các phòng thí nghiệm của Pravdin (1973) [19], Shareck (1990) [50], Michael King (1995) [66] và Quentin Bon (2008) [76].

Quan sát hình thái tuyến sinh dục của cá Ong căng bằng mắt thường và kính lúp

36

hai mắt theo quan điểm của Kiselevits (1923) và nghiên cứu tổ chức học bằng các tiêu bản tuyến sinh dục và đọc tiêu bản theo Xakun và Buskaia (1968) [41].

Phương pháp hình thái:

Xác định khối lƣợng tuyến sinh dục (TSD) cá bằng cân tiểu li. Từ đó xác định sức sinh sản tuyệt đối bằng phương pháp đếm trên đơn vị khối lượng TSD và sức sinh sản tương đối của cá Ong căng theo công thức:

Sức sinh sản tuyệt đối: T  x wt Sức sinh sản tương đối:

W t T Trong đó: T: Sức sinh sản tuyệt đối

t: Sức sinh sản tương đối (trứng/g) wt: Khối lƣợng buồng trứng (g) W: Khối lƣợng cơ thể cá (g)

x: Số trứng có trong một g của buồng trứng

Nghiên cứu tổ chức học tuyến sinh dục: Làm tiêu bản nghiên cứu cấu trúc tế bào của buồng trứng và tinh sào

+ Cố định mẫu: Sử dụng dung dịch Bouin để cố định mẫu trong thời gian từ 4 – 24 giờ. Sau khi cố định xong, tiến hành rửa mô. Thời gian rửa bằng thời gian cố định nếu rửa bằng nước, hoặc rửa trong cồn 50%, sau đó chuyển sang cồn 7% để bảo quản trong thời gian dài.

+ Cắt tỉa và định hướng cho mẫu mô đã được cố định: Mẫu mô có thể đƣợc cắt tỉa bằng lƣỡi dao cạo hoặc dao mổ để đạt đƣợc kích cỡ mong muốn.

+ Loại nước, làm trong mẫu, ngấm paraffin: Quá trình loại nước được thực hiện bằng cách nhúng mẫu mô qua một loạt các dung dịch cồn với các nồng độ gia tăng (10% cho mỗi bước) từ cồn 50% đến cồn 80%, sau đó nhúng mẫu vài lần trong cồn 95% và cuối cùng là chuyển sang cồn 100%. Tiếp theo ngâm mẫu trong dung môi xylen trong thời gian từ 30 phút đến 2 giờ để loại bỏ cồn. Mẫu đƣợc ngâm trong các lọ paraffin nóng chảy (57 – 60o) với thời gian từ 1 – 3 giờ tùy theo kích thước mô.

37

+ Đúc khối: Mẫu mô đã đƣợc ngấm paraffin tốt sẽ đƣợc đặt trong khuôn bằng nhựa hay inox. Định hướng miếng mô cho đúng, cẩn thận đổ paraffin nóng chảy vào khuôn. Sau đó đặt vào tủ lạnh để làm rắn khuôn, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn.

+ Cắt mẫu: Mục đích của bước này nhằm cắt mẫu mô thành những lát thật mỏng có khả năng cho ánh sáng xuyên qua để quan sát bằng kính hiển vi.

+ Nhuộm tiêu bản: bằng phương pháp HS/HE (Hematoxylin - sắt đối với tuyến sinh dục đực và Hematoxylin - Eosin đối với tuyến sinh dục cái); đọc tiêu bản dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40 đến 1000 lần theo quan điểm của Xakun và Buskaia (1968) [41]. Từ đó, đánh giá dự đoán thời gian đẻ trứng của cá.

2.4.4. hăm dò khả năng nhân giống của cá Ong căng 2.4.4.1. Tuyển chọn đàn cá tham gia sinh sản nhân tạo

Thu gom, tuyển chọn từ cá Ong căng ngoài tự nhiên có chất lƣợng tốt (khỏe mạnh, không bị bệnh, không dị tật,...), bằng cách thuê các ngƣ dân khai thác cá từ các cửa sông, cửa biển, trong đầm phá và vùng ven biển tỉnh Thừa Thiên Huế hoặc từ các hộ nuôi trồng thủy sản.

Cá bố mẹ trước khi đưa vào nuôi vỗ cần có thời gian thuần dưỡng để cá dần dần thích nghi với điều kiện sống bán nhân tạo, đặc biệt đối với cá có nguồn gốc ngoài tự nhiên. Nước biển trong nuôi thuần dưỡng cần được điều chỉnh độ mặn tương đồng với môi trường tự nhiên, sau đó sẽ điều chỉnh dần theo độ mặn của trại sản xuất trong quá trình thuần dƣỡng khí oxi (O2) đƣợc cung cấp đầy đủ.

2.4.4.2.Ảnh hưởng của các loại thức ăn đến khả năng thành thục

Thí nghiệm được tiến hành với 02 nghiệm thức, tương ứng với các loại thức ăn khác nhau, mỗi thí nghiệm đƣợc lập lại 3 lần. Cá đƣợc bố trí ngẫu nhiên vào các lô thí nghiệm theo các bể composite ngoài trời có thể tích 50m3 (kích thước 5m x 5m x 2 m, mức nước: 1,3-1,5 m). Các điều kiện về môi trường và chăm sóc tương tự nhau, khác nhau về yếu tố thức ăn. Từ kết quả nghiên cứu đặc điểm dinh dƣỡng của cá, chúng tôi chọn thức ăn chính là cá tạp và mực tươi.

+ NT1 (nghiệm thức 1): Cho cá ăn 50% cá tạp + 50% mực tươi + NT2 (nghiệm thức 2): 100% cá tạp

Số lƣợng cá nuôi: 40 con/bể.

38 Tỷ lệ cá đực/cái là 1 : 1.

Thức ăn sử dụng: Thức ăn đƣợc cắt nhỏ, cho cá ăn khoảng 2 - 5% khối luợng cơ thể, mỗi ngày 2 lần (7 – 8 giờ (h) sáng và 16 – 17h chiều). Có trộn thêm các Vitamin E; C; Premix khoáng và Bokashi trầu, định kỳ 3 ngày một lần.

Các chỉ tiêu theo dõi: Các yếu tố môi trường thông thường, tốc độ sinh trưởng, biểu hiện phát dục và tỷ lệ thành thục.

(Trước khi cá đưa vào bố trí thí nghiệm được tiến hành cân khối lượng và đo chiều dài cá theo cách lấy ngẫu nhiên 9 con trong đàn làm đại diện).

Định kỳ hàng tháng kiểm tra sự thành thục của cá:

- Kiểm tra cá đực: Dùng tay vuốt nhẹ phía trên lỗ sinh dục khoảng 5 cm, thấy có tinh dịch màu trắng sữa chảy ra, vậy cá đực đã thành thục tốt, có biểu hiện tinh dịch màu trắng đặc, nhiều, phát tán nhanh trong nước. Còn những cá đực thành thục kém là có biểu hiện tinh dịch loãng và ít.

- Kiểm tra cá cái: bằng phương pháp chọn ngoại hình:

+ Phương pháp chọn ngoại hình: Cá có bụng to, thuôn đều, bụng cá mềm đều từ trên xuống dưới, khoảng giữa ngực và bụng hơi lõm xuống, thành bụng của cá mỏng, vùng chung quanh lỗ sinh dục có màu hồng tươi, cương phồng, lỗ hậu môn mở rộng, vẩy xung quanh lỗ hậu môn dãn ra là xác định cá thành thục.

Theo dõi tỷ lệ thành thục của cá ở các nghiệm thức cho đến khi có ít nhất 50%

số cá ở một nghiệm thức thành thục sinh dục (cá có tuyến sinh dục ở GĐ IV) tạm dừng. Thời gian bắt đầu thí nghiệm nuôi vỗ đến khi kết thúc là 5 tháng nuôi, lúc kết thúc cá đạt tiêu chuẩn về sự thành thục, chúng ta tiến hành kích thích sinh sản.

- Tiến hành giải phẫu ngẫu nhiên ở mỗi nghiệm thức 09 con cá để để xác định các GĐ phát triển của tuyến sinh dục.

+ GĐ phát triển của tuyến sinh dục: theo thang 6 bậc của Xakun và Buskaia (1968) để đánh giá sự phát triển của tuyến sinh dục cá Ong căng trong quá trình nuôi vỗ [41].

2.4.4.3. Thăm dò khả năng sinh sản

Cá bố mẹ sau khi nuôi vỗ thành thục sinh dục đƣợc tuyển chọn theo các tiêu chí: Cá đực có khối lƣợng 100 – 200 g; cá cái có khối lƣợng 200 – 400 g, cá khỏe mạnh không nhiễm bệnh; cá cái bụng to, mềm đều, phần phụ sinh dục màu hồng; đã

39

được thăm trứng tốt như: trứng có đường kính đều nhau, rời, tròn đều và có màu vàng nhạt, đường kính trứng từ 0,5 – 0,7 mm chúng tôi tiến hành cho sinh sản.

Riêng cá đực có thân thon dài, khi vuốt nhẹ bụng gần phần phụ sinh dục thấy có sẹ màu trắng sữa chảy ra.

Tiến hành bố trí 02 thí nghiệm về các phương pháp kích thích sinh sản bằng tiêm 02 loại thuốc LRH-A3 (μg/kg) + DOM (3 mg/kg) và HCG với liều lƣợng nhƣ bảng 2.2.

Bảng 2.2. Các loại và nồng độ chất kích thích sinh sản cá Ong căng Thí nghiệm Loại thuốc sử dụng Liều lƣợng

01 LRH-A3 (μg/kg) + DOM (3 mg/kg) 40 70 100

02 HCG (IU/kg) 250 500 750

Liều lƣợng cỏ đực giảm ẵ so với liều cho cỏ cỏi. Cỏ cỏi đƣợc tiờm kớch dục tố 2 lần (lần 1: tiêm 1/3 lƣợng thuốc cần tiêm, sau khoảng 7 đến 8 giờ, tiêm lần 2, liều quyết định với 2/3 lƣợng thuốc còn lại). Sau khi cá đƣợc tiêm kích thích tố, cho cá đẻ ở trong bể composites 0,5-1 m3 có dạng hình tròn, có dây sục khí, độ sâu cột nước từ 1,2-1,5 m, có 1 ống cấp và 1 ống thoát nước để thuận tiện cho việc thu trứng, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thu trứng. Bể cần vệ sinh sạch sẽ; mỗi bể đẻ cho vào 2 cặp cá đã đƣợc xác định có thời điểm chín muồi sinh dục.

Nguồn nước được lắng lọc qua bể cát và cấp vào bể đẻ, với độ mặn 29 – 30‰, duy trì nhiệt độ nước ở 28 – 31oC, pH 7,5 – 8,5. Hàm lượng oxy hòa tan (DO) >5mg/l.

Sục khí liên tục và có, dùng lưới đen hoặc bạt che để giảm ánh ánh sáng bên ngoài vào bể tạo nên sự yên tĩnh cần thiết cho cá.

Ấp trứng: Bố trí bể ấp có dạng hình tròn, với thể tích thường 500 – 1.000 lít, được vệ sinh sạch sẽ và khử trùng trước khi đưa vào ấp trứng.

Nguồn nước cung cấp vào bể ấp sạch và đảm bảo các yếu tố môi trường: độ mặn khoảng 29 – 30‰, nhiệt độ khoảng 28 – 29oC, DO trong nước duy trì > 5mg/l và đƣợc duy trì sục khí nhẹ, liên tục trong quá trình ấp.

Khi cá nở, chúng tôi xác định tỷ lệ cá bột và tỷ lệ nở của trứng sớm, đồng thời xác định cá bột nổi trên mặt nước, trứng ung và vỏ trứng sẽ chìm dưới đáy bể, tiến hành Xi phông để loại bỏ trứng ung và vỏ ra khỏi bể ấp, sau đó chuyển cá bột sang bể ƣơng.

40

Các chỉ tiêu đƣợc theo dõi bao gồm: sức sinh sản thực tế (số trứng/cá cái), tỷ lệ thụ tinh (%), tỷ lệ nở (%).

2.4.4.4. Nghiên cứu quy trình ương từ cá bột lên cá hương

Quy trình ương cá giống GĐ cá bột lên cá hương khoảng 15 ngày tuổi, chúng tôi tiến hành bố trí 2 thí nghiệm.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thức ăn đến tỷ lệ sống của cá GĐ từ bột đến hương

Thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức (NT) với 04 tổ hợp khẩu phần thức ăn khác nhau, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần và cá đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên vào các bể ƣơng.

NT1: Tảo Nanochoropsis oculata và luân trùng Brachiunus rotudifordiformis NT2: Tảo Nanochoropsis oculata và Nauplius của Artemia

NT3: Tảo Nanochoropsis oculata và thức ăn công nghiệp NT4 : Thức ăn công nghiệp

Mật độ tảo đơn bào là 5.105 tế bào/ml (tb/ml); mật độ luân trùng cho vào là 15 con/ml; Artemia là 2 con/ml. Cho cá ăn thức ăn tự nhiên và tảo đơn bào ngay từ ngày thứ nhất, luân trùng, Nauplius của Artemia, và thức ăn công nghiệp bắt đầu cho ăn từ ngày thứ 3 trở đi. Thức ăn công nghiệp sử dụng trong thí nghiệm này là Grobest (Đài Loan).

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn đến tỷ lệ sống của cá GĐ từ bột đến hương

Các nghiệm thức đƣợc bố trí dựa vào sự biến động của yếu tố độ mặn ở đầm phá Tam Giang trong mùa sinh sản của cá Ong căng. Vì vậy các mức độ mặn khác nhau gồm NT1 - 20‰, NT2 - 25‰, NT3 - 30‰. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên.

Chăm sóc và quản lý:

Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Trung tâm Thực hành Thuỷ Sản Phú Thuận, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế trong các năm 2015, 2016, 2017. Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong bể composite hình tròn có thể tích 500 lít, mật độ ƣơng là 40 con/lít, bể ƣơng có chế độ sục khí 24/24, lƣợng khí cung cấp đƣợc tăng