Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng bón phân hữu cơ vi sinh đến sự biến động của VSV có ích trong đất trồng chè và sự biến động của sinh vật hại chính trên chè
Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng bón phân hữu cơ vi sinh đến sự biến động của VSV có ích trong đất
* Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của lượng bón phân hữu cơ vi sinh đến sự biến động của VSV có ích trong đất.
+ Công thức 1 - Nền (đối chứng): Bón theo quy trình của Bộ Nông nghiệp (bón phân vô cơ theo tỷ lệ N:P:K=3:1:1 {300N + 100P2O5 + 100K2O/năm)
+ Công thức 2: Bón phân hữu cơ vi sinh ở mức 1,0 tấn/ha/năm + Nền + Công thức 3: Bón phân hữu cơ vi sinh ở mức 2,0 tấn/ha/năm + Nền + Công thức 4: Bón phân hữu cơ vi sinh ở mức 3,0 tấn/ha/năm + Nền
Phương pháp bón phân hữu cơ:
Bón một lần vào đầu năm (tháng 2), bón vào thời điểm có mưa, đất ẩm. Bón phân bằng hình thức cuốc hố sát gốc chè (cách gốc 15-30cm, hố sâu 10-15cm).
Phương pháp phân tích chỉ tiêu chung + Phương pháp nghiên cứu VSV đất:
- Phương pháp lấy mẫu đất: Mẫu đất được lấy ở độ sâu 6 - 15 cm, sau khi đã loại bỏ khoảng 5 cm phần đất mặt và tàn dư thực vật.
- Phương pháp phân tích các chỉ tiêu vật lý:
Dung trọng khô của đất được xác định bằng cách đóng ống kim loại hình trụ (ống ring) có thể tích bên trong gần 100 cm3 thẳng với bề mặt đất nhằm thu mẫu đất, sau đó đem sấy khô kiệt rồi tính theo công thức sau:
d = P/V Trong đó:
d: dung trọng của đất (g/cm3).
P: khối lượng đất tự nhiên trong ring sau khi đã được sấy khô kiệt (gam).
V: thể tích của ring (cm3).
Tỷ trọng đất được xác định bằng phương pháp Picromet (Bình tỷ trọng). Đất được cân trong nước để xác định một đơn vị thể tích đất nằm ở trạng thái xếp sít vào nhau. Sau đó chia trọng lượng đất khô kiệt (cũng đã được cân trong bình Picromet) cho thể tích đất nằm ở trạng thái xếp xít vào nhau.
Tỷ trọng được tính bằng công thức:
Trong đó:
D: Tỷ trọng của đất (g/cm3 ) P: Trọng lượng đất khô kiệt.
B: Trọng lượng bình Picromet + nước.
C: Trọng lượng bình Picromet + nước + đất.
Độ xốp là tỷ lệ phần trăm các khe hở trong đất so với thể tích đất. Độ xốp đất được tính theo công thức:
Trong đó:
P: Độ xốp (%)
d: Dung trọng đất (g/cm3) D: Tỷ trọng đất (g/cm3)
Sức chứa ẩm tối đa là độ chứa ẩm ứng với khả năng giữ nước lớn nhất của đất. Cách xác định độ ẩm tối đa: dùng ống lấy mẫu đất, đặt vào chậu nước cho bão hoà rồi đặt lên rây cho nước trọng lực chảy hết (chỉ còn nước mao quản) và đem xác định được độ ẩm tối đa.
- Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa học:
Phương pháp phân tích chất hữu cơ trong đất được xác định theo phương pháp Walkley- Black. Phân tích lân dễ tiêu trong đất: bằng dung dịch trích sodium hydrogen carbonate theo phương pháp Olsen. Đạm hữu cơ dễ phân hủy được trích với KCl 2M đun nóng ở 100oC trong 4 giờ. Đạm NH4 + - N được phân tích theo phương pháp Kjeldahn.
- Phương pháp phân lập và xác định số lượng tế bào VSV [10] (Viện Thổ nhưỡng nông hóa thực hiện).
D = P
P + B - C
P (%) = d
1- D x 100
- Phương pháp xác định các chủng VSV có khả năng phân giải xenlulo, phân giải lân, kích thích sinh trưởng và cố định nitơ tự do [10].
- Phương pháp đánh giá khả năng phân giải xenlulo [37]: Cấy các chủng vi sinh vật đã phân lập vào các bình tam giác chứa môi trường trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng (không có agar), pH = 6,8, tốc độ lắc 200 vòng/ phút, ở nhiệt độ 37oC, thời gian 12 - 14 giờ. Thu enzym ngoại bào trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp ly tâm với vận tốc 5000 vòng/ phút trong thời gian 20 phút. Dùng khoan đường kính 10mm đục lỗ thạch ở chính giữa. Bổ sung 50àl dịch chiết enzym vào giếng, đặt trong tủ lạnh trong 2 ngày. Lấy 1ml dung dịch thuốc thử congo đỏ dàn đều trên bề mặt thạch. Nếu enzym có hiệu lực thì xung quanh lỗ khoan xuất hiện vòng thuỷ phân (vòng trong suốt). Đường kính vòng phân giải được tính theo công thức: V(mm) = D (mm) - d (mm)
Trong đó: D-Đường kính vòng phân giải; d- đường kính lỗ khoan.
- Phương pháp đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát khó tan [12]: Sử dụng môi trường NBRIP với nguồn phốt phát khó tan là AlPO4. Môi trường được chia vào các ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, sau đó hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC và 1 atm. Cấy chủng vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần. Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường để làm phản ứng molipdate, xác định nồng độ PO4.
- Phương pháp đánh giá khả năng phân huỷ tinh bột [14]: Cấy chủng vi sinh vật lên môi trường đặc Nutrient agar có chứa tinh bột (1%w/v). Sau 3 ngày ủ ở 30oC, các khuẩn lạc được hình thành, amylase được tổng hợp, thủy phân tinh bột và tạo thành một vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc. Rót dung dịch Gram’s Iodine lên mặt thạch, tráng đều và quan sát để kiểm tra sự thủy phân tinh bột. Dựa vào tỉ lệ giữa đường kính của vòng thủy phân với đường kính của khuẩn lạc để đánh giá khả năng phân huỷ tinh bột.
- Phương pháp đánh giá khả năng sinh màng nhày: Các chủng vi sinh vật được nuôi trong môi trường có chứa pepton, chiết xuất nấm men (yeast extract) chiết xuất mạch nha (malt extract) và đường glucose ở 27oC [137]. Sau 3 ngày nuôi cấy, loại tế bào khỏi dịch nuôi cấy bằng cách li tâm ở 4000 rpm/phút trong 20 phút.
Sau li tâm, thu phần dịch nổi để xác định độ nhớt, dựa vào độ nhớt để đánh giá khả năng sinh màng nhày.
+ Phương pháp bố trí thí nghiệm: thí nghiệm (TN) được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần nhắc, mỗi ô thí nghiệm có diện tích 45 m2, không bao gồm dải bảo vệ (hai chè hàng xung quanh ô thí nghiệm).
Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng bón phân hữu cơ vi sinh đến sự biến động của sinh vật hại chè
* Thí nghiệ m 2: Ả nh hư ở ng củ a việ c bón thay thế lư ợ ng phân khoáng bằ ng phân hữ u cơ vi sinh (tính bằ ng lư ợ ng bón) đ ế n sự biế n đ ộ ng củ a các sinh vậ t hạ i chính trên chè LDP1
+ Công thức 1 - Nền (đối chứng): 300N + 100P2O5 + 100K2O
+ Công thức 2: 70% Nền + 30% Nền bằng phân bón hữu cơ vi sinh Sông Gianh + Công thức 3: Nền + 30% Nền bằng phân bón hữu cơ vi sinh Sông Gianh - Thí nghiệm này sử dụng phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh.
- Liều lượng quy đổi 30% Nền bằng phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh là 1.600kg/ha/năm (quy đổi theo lượng bón dựa vào khuyến cáo sử dụng phân bón HCVS Sông Gianh của nhà sản xuất - Phụ lục 1.6). Bón 2 lần/năm.
* Thí nghiệ m 3: Ả nh hư ở ng củ a việ c bón thay thế lư ợ ng phân khoáng bằ ng phân hữ u cơ vi sinh (qui giá trị ) đ ế n sự biế n đ ộ ng củ a các sinh vậ t hạ i chính trên chè LDP1.
+ Công thức 1 - Nền (đối chứng): 300 N + 100 P2O5 + 100 K2O
+ Công thức 2: Thay 20% giá trị phân khoáng bằng bón phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh
+ Công thức 3: Thay 30% giá trị phân khoáng bằng bón phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh
- Liều lượng quy đổi 20% và 30% giá trị phân khoáng bằng phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh lần lượt là 590kg và 890kg/ha/năm (Phụ lục 1.6).
+ Phương pháp điều tra thành phần, mức độ phổ biến của sâu hại:
Tiến hành điều tra định kì 7-10 ngày/lần, điều tra ngẫu nhiên 5 điểm, mỗi điểm lấy 2 điểm nhỏ, mỗi điểm nhỏ trên 1 hàng chè dài 1,0m dài (hoặc 3 cây chè) dùng túi nilon to bao phủ tán chè đập và rung cho tất cả các cá thể rơi vào rồi tiến hành đếm và phân loại. Xác định tần suất lặp (bắt gặp) từng loại sâu cụ thể.
- Điều tra mật độ rầy xanh: Định kỳ điều tra 7-10 ngày/lần điều tra. Dùng khay kim loại (nhôm, hoặc khay tráng men) có kích thước 35 x 25 x 5 cm, dưới đáy tráng một lớp mỏng dầu mazut (hoặc dầu luyn) đặt khay dưới gầm, rìa tán chè nghiêng 450 so với thân cây, dùng tay đập mạnh trên tán chè 3 đập thẳng góc với khay, sau đó đếm số rầy trên khay.
- Điều tra mật độ bọ cánh tơ: Điều tra định kỳ 7-10 ngày /1 lần, vào buổi sáng. Hái 5 điểm, mỗi điểm 20-25 búp cho vào túi PE đem về phòng đếm số bọ trĩ trên từng búp và phân cấp bị hại, tính theo công thức:
- Điều tra mật độ nhện đỏ: hái 5 điểm, mỗi điểm 20 lá bánh tẻ, lá già, cho vào túi PE về phòng đếm số nhện và phân cấp độ hại, tính:
- Điều tra bọ xít muỗi: điều tra theo 5 điểm, mỗi điểm hái ngẫu nhiên bất kì 20-25 búp, cho vào túi PE về phòng đếm số búp có vết do bọ xít muỗi hại, tính tỉ lệ
% búp bị hại theo công thức:
Mật độ nhện đỏ =
số nhện
số lá điều tra
(con/lá) Mật độ bọ cánh tơ = bọ cánh tơ đếm được
búp điều tra
(con/búp) Mật độ rầy xanh =
Tổng số con đếm được
Tổng số khay điều tra (con/khay)
+ Phương pháp đánh giá mức độ thiệt hại do sâu bệnh gây ra: Các loại sâu hại như rầy xanh, bọ cánh tơ, bọ xít muỗi được đánh giá như sau:
Chọn 5 điểm, mỗi điểm hái búp chè đủ tiêu chuẩn (1 tôm 2-3 lá) 1m chiều dài (0,5 m/hàng x 2 hàng) cho vào túi PE đem về phòng phân cấp:
- Đối với rầy xanh: phân các cấp gây hại Cấp 0: Búp không bị hại;
Cấp 1: Vết hại dải rác, búp chè chuyển màu hồng;
Cấp 2: Lá hơi cong, biến dạng, khô từ 1.3 mép lá;
Cấp 3: Lá biến dạng, cong, khô mép lá.
- Đối với Bọ cánh tơ: phân các cấp gây hại Cấp 0: Búp không bị hại;
Cấp 1: Vết hại rải rác, riêng rẽ;
Cấp 2: Búp có 2 vết nằm song song gân chính;
Cấp 3: Búp dày, giòn, chùn lại và biến dạng.
- Đối với Bọ xít muỗi: phân các cấp gây hại Cấp 0: Búp không bị hại;
Cấp 1: Vết hại rải rác, riêng rẽ;
Cấp 2: Búp có lá biến dạng;
Cấp 3: Búp có lá khô nhăn nheo, co dúm lại.
- Tính chỉ số hại:
Trong đó: a = số búp bị hại ở mỗi cấp; b = số cấp tương ứng N= tổng số búp điều tra; T cấp cao nhất.
+ Phương pháp điều tra thành phần loài thiên địch:
Chọn 5 điểm chéo góc với diện tích mỗi điểm là 1m2. Sử dụng vợt côn trùng Chỉ số % bị hại =
(a x b) N x T
Búp bị hại (%) = số búp bị hại
số búp điều tra
x 100
để thu các mẫu côn trùng bắt mồi có mặt tại mỗi điểm, điều tra định kì 7 ngày 1 lần.
Song song với điều tra định kì, áp dụng phương pháp thu bắt theo khay đối với côn trùng bắt mồi trên tán chè (ví dụ như bọ rùa). Áp dụng phương pháp điều tra theo búp đối với côn trùng bắt mồi trên búp chè (ví dụ như nhện đỏ). Mỗi lần điều tra 25 điểm. Tiến hành xác định vật mồi ưa thích của một số loài bắt mồi phổ biến. Bỏ đói những mẫu thiên địch thu được để chúng bài tiết hết chất thải, chần qua nước sôi và bảo quản trong dung dịch cồn. Đối với những loài có cánh, mẫu được được bảo quản ở trạng thái khô. Sau đó tiến hành giám định tên, thành phần loài (do Viện Bảo vệ thực vật thực hiện), xác định số lượng.